Trộn với lợng silicagel vừa đủ rồi đảo đều, sau đó lại tiếp tục cách thuỷ đảo đều tay đến khi khô tạo thành bột mịn.
Cột sắc kí đợc cho 1 lớp bông phía dới, đổ vào 1/3 cột silicagel, sau
đó đổ bột cao mịn khô(cao butanol) vào, rồi tiếp tục đổ 1 lớp silicagel mỏng lên phía trên và cho thêm một lớp bông ở trên cùng.
Các hệ dung môi rửa giải: Tỉ lệ các hệ dung môi CHCl3 (Clorofom) MeOH (Metanol) H2O (Nớc) Hệ 1 30 01 0,05 Hệ 2 20 01 0,05 Hệ 3 10 01 0,05 Hệ 4 04 01 0,05
Trong quá trình chạy cột tốc độ chạy đợc khống chế ổn định, không thay đổi trong toàn bộ quá trình chạy cột (120 giọt/phút). Dung môi luôn đợc duy trì không để khô cột.
Sau khi phân tích dung dịch chảy ra khỏi cột của từng hệ ta có thể phân ra nh sau:
Hệ dung môi rửa giải Kí hiệu các bình tơng ứng sau khi cất thu hồi dung môi
Hệ 1(30:01:0,05) PUB 01→PUB 04
Hệ 2(20:01:0,05) PUB 05→PUB 08
Hệ 3(10:01:0,05) PUB 09→PUB 33
Hệ 4(04:01:0,05) PUB 34→PUB 38
Sau đó dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra độ sạch và tìm hệ dung môi tách thích hợp. Hệ dung môi dùng cho sác kí bản mỏng, tuy đã dùng các tỉ lệ nh: 40:1:0,05; 30:1:0,05 cho đến 5:1:0,05 và 3:1:0,05( tăng dần tính phân cực … của hệ) thì thấy có sự xuất hiện chất trên bản mỏng.
Hình 2.5. Sự xuất hiện của các chất trên bản mỏng Tỉ lệ hệ dung môi dùng cho sắc kí bản mỏng CHCl3 MeOH H2O Hệ 1 05 01 0,05 Hệ 2 03 01 0,05
Sau khi xử lí bằng sắc kí bản mỏng, những bình có các vạch ngang nhau xếp cùng vào một chỗ, còn các bình có các vạch riêng đợc xếp riêng ra, đồng thời cho ta thấy dấu hiệu của sự có mặt các chất. Sau khi xử lí bởi hệ 1 ta gom đợc các lọ từ PUB 8→PUB 18, và hệ 2 ta gom đợc các lọ từ PUB 13→PUB 28.
Hệ dung môi dùng cho bản mỏng
Các lọ gom lại sau khi xử lí
Hệ 1(05:01:0,05) PUB 08→PUB 18
Hệ 2(03:01:0,05) PUB 13→PUB 28
Các lọ trên đợc để bay hơi tự nhiên thì từ PUB 8→PUB 28 xuất hiện kết tinh.
Hình 2.6. Lọ đựng các chất tách đợc sau khi xử lí
ở lọ PUB 14 xuất hiện các tinh thể màu trắng, còn các lọ PUB 12, 13, 14, 16, 20 có kết tinh khô hơi vàng.
Tiến hành rửa sạch PUB 15, PUB 12, PUB 13, PUB 14, PUB 16, PUB 20 bằng dung môi axeton, rồi thử lại bằng bẳn mỏng cho đến khi sạch.
Sau khi xử lí sạch các lọ trên, ta tiến hành đo phổ.
Quá trình tách các chất đợc mô tả bằng sơ đồ 10 kg mẫu khô Dịch chiết metanol Chiết nóng với metanol Cao metanol (75 gam)
Cất thu hồi dung môi metanol
Chiết với dung môi clorofom
(75 gam)
Chiết với dung môi butanol
(75 gam)
Cao clorofom
(30 gam) Cao butanol(45 gam)
Cất thu hồi dung môi clorofom (75 gam) Quay cất dung môi butanol Cao butanol (45 gam) Hệ dung môi chạy cột 30:1:0,05 20:1:0,05 10:1:0,05 4:1:0,05
Phân đoạn 1- 4 Phân đoạn 5- 8 Phân đoạn 9- 33 Phân đoạn 34- 38
Có 2 chất A và B Rửa sạch bằng CH3OH
Kết tinh lại trong axeton Có 2 chất A và B
Các chất A và B đợc đo điểm chảy, chụp phổ để xác định cấu trúc tại Viện hoá học – Viện khoa học và công nghệ quốc gia.
2.3.4. Đo phổ
Phổ 13C – NMR ( DMSO – C13PD, DMSO – HMBC) đợc ghi trên thiết bị BRUKER-ADVANCE-125MHZ.
Phổ 1H – NMR (DMSO – 1H, DMSO – HSQC, DMSO-HMBC) đợc ghi trên thiết bị BRUKER-ADVANCE-500MHZ.
Phổ khối lợng đợc đo trên trên máy Agilent Technologies 1100 Series LC/MSD Trap SL.
Chơng 3