nghiên cứu
3.1 Đối t−ợng nghiên cứu
Đối t−ợng nghiên cứu của chúng tôi gồm:
- Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) thuộc các quần thể tự nhiên đ−ợc thu thập ở các địa điểm nghiên cứu: Quất L−u - Bình Xuyên – Vĩnh Phúc, Nghĩa Tân - Nghĩa H−ng – Nam Định, Tô Hiệu - Th−ờng Tín – Hà Nội.
- Dòng rầy nâu mẫn cảm đ−ợc Viện BVTV nhân nuôi từ năm 2007 có nguồn gốc từ dòng rầy của Nhật Bản nuôi từ năm 1989.
3.1.1 Các trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
- Nhà l−ới, lồng l−ới (bao gồm lồng to có kích th−ớc 60x60x120 cm, lồng nhỏ có kích th−ớc 40 x 40 x 60 cm), các trang thiết bị cần thiết khác phục vụ cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm nh− điều hoà nhiệt độ, máy hút ẩm, lọ thủy tinh, micro pipet, mycro syrine, bình CO2
ảnh 5: Máy nhỏ giọt Mycro syrine
- Các dụng cụ phục vụ cho thí nghiệm ngoài đồng ruộng nh− khay, cốc đong và dụng cụ để pha thuốc trừ sâu có độ chính xác cao, bình phun thuốc trừ sâu loại 10 lít.
3.1.2 Thuốc trừ sâu thử nghiệm
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 3 loại thuốc trừ sâu đ5 và đang đ−ợc nông dân trồng lúa ở các địa điểm nghiên cứu sử dụng nhiều trong việc phòng trừ sâu hại lúa, đó là các thuốc:
1. Bassa 50 EC: thuộc nhóm độc II, trong 100 ml thuốc th−ơng phẩm có chứa 50 gam hoạt chất Fenobucarb. Thuốc thuộc nhóm thuốc carbamate. Thuốc kìm h5m hoạt động của enzim Acetylcholin esterase quá trình thủy phân enzim AchE sẽ tạo ra kích thích hoạt động của chất dẫn truyền xung động thần kinh Acetylcholine trên xinap khiến côn trùng có thể bị tử vong. Thuốc có đặc tính tiếp xúc không có tác dụng nội hấp.
2. Confidor 700 WG: thuộc nhóm độc II, trong 100 g thuốc th−ơng phẩm có chứa 70 gam hoạt chất Imidacloprid. Thuốc thuộc nhóm thuốc Neonicotinoid. Thuốc tác động đến thần kinh trung −ơng, làm tê liệt thụ quan nicotin-axetylcolin màng sau xinap. Thuốc có đặc tính tác dụng nội hấp, tiếp xúc và vị độc.
3. Regent 800 WG: thuộc nhóm độc II, loại thuốc này chứa 80 gam hoạt chất Fipronil trong 100 g thuốc th−ơng phẩm. Thuốc này thuộc nhóm Phenylpyrazol, thuốc có tác động ức chế hoạt động của GABA, chất điều khiển kênh ion Chloride nằm trên tế bào thần kinh xinap dẫn đến làm ng−ng dòng ion đi qua. Có hiệu lực cao với các loài sâu hại đ5 hình thành tính kháng thuốc với các nhóm Lân hữu cơ, Pyrethroid, Cacbamat thuốc có đặc tính tiếp xúc, vị độc.
3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1 Địa điểm
Thí nghiệm trong phòng: các nghiên cứu trong phòng đ−ợc tiến hành tại Phòng thí nghiệm - Trung tâm Kiểm định và khảo nghiệm thuốc Bảo vệ thực vật phía Bắc - Cục Bảo vệ thực vật.
nghiệm ngoài đồng ruộng tại 3 địa điểm là những vùng trồng lúa có mức độ thâm canh cao và có điều kiện khí hậu đặc tr−ng.
- Th−ờng Tín - Hà Nội: đây là một huyện có diện tích trồng lúa lẫn cây mầu lớn của tỉnh Hà Tây cũ, cách Hà Nội 15 km về phía Nam.
- Nghĩa H−ng – Nam Định: là một huyện nằm gần biển của tỉnh Nam Định, cách TP Nam Định khoảng 60 km.
- Bình Xuyên – Vĩnh Phúc: là một huyện có diện tích trồng lúa quanh năm với diện tích lớn. Địa điểm này nằm cách Hà Nội khoảng 50 km về phía Đông Bắc.
Nh− vậy 3 địa điểm mà chúng tôi đ5 chọn đều có ý nghĩa rất lớn về mặt sản xuất và chúng có những kiểu khí hậu hoặc luân canh cây trồng khác nhau, sự khác biệt này cũng có thể làm ảnh h−ởng đến tính kháng thuốc của rầy nâu giữa các địa điểm nghiên cứu.
3.2.2 Thời gian
Từ tháng 1/2009 đến tháng 11/2009
3.3 Nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Điều tra diễn biến mật độ rầy nâu trên đồng ruộng
Thời gian điều tra: định kỳ 7 ngày 1 lần trong suốt vụ xuân 2009.
Ph−ơng pháp: tiến hành theo ph−ơng pháp của Cục Bảo vệ thực vật (1987) [3], Viện Bảo vệ thực vật (2000) [23]. Cụ thể nh− sau:
Tại mỗi địa điểm nghiên cứu chọn 3 ruộng khác nhau và cách nhau khoảng 300 mét, mỗi ruộng chọn 5 điểm trên 2 đ−ờng chéo góc. Tại mỗi điểm điều tra 4 khóm, mỗi khóm dùng khay tráng dầu có kích th−ớc 20 cm x 20 cm đập 2 đập, đếm số rầy nâu có trong khay.
Chỉ tiêu theo dõi: mật độ (con/khóm)
3.3.2 Điều tra tình hình sử dụng thuốc trừ sâu trên lúa của nông dân
Ph−ơng pháp: sử dụng ph−ơng pháp phỏng vấn trực tiếp trên đồng ruộng đối với nông dân (29-35 nông dân/điểm nghiên cứu) dựa trên một bộ
mẫu các câu hỏi (phụ lục). Bộ câu hỏi này nhằm thu thập các thông tin sau: - Các loại thuốc bảo vệ thực vật nông dân đ5 và đang sử dụng để trừ sâu hại lúa trên đồng ruộng của họ.
- Số lần phun thuốc trong một vụ lúa. - Khoảng cách giữa hai lần phun thuốc - Ph−ơng thức sử dụng thuốc của nông dân.
3.3.3 Thu thập và nhân nuôi rầy nâu
Chuẩn bị mạ: sử dụng giống Nhị −u 63
ảnh 6: Chuẩn bị mạ để nhân nuôi rầy
Thu thập rầy cái cánh ngắn ngoài đồng ruộng bằng ống nghiệm hoặc ống hút chuyên dụng. Sau đó rầy cái đ−ợc thả vào các khay mạ (2 tuần tuổi) để lấy trứng. Các khay đ−ợc thay sau 24 h để đảm bảo mức độ đồng đều vê tuổi của rầy nâu sau này. Các khay mạ sau khi cho rày tr−ởng thành đẻ trứng
đ−ợc cách ly hoàn toàn với các quần thể rầy nâu bằng lồng có kích th−ớc 120 cm x 60 cm x 60 cm và đ−ợc chăm sóc cho tới khi rầy nâu phát triển thành tr−ởng thành để dùng cho thí nghiệm. Số rầy tr−ởng thành không dùng làm thí nghiệm thì tiếp tục đ−ợc nhân nuôi trong phòng thí nghiệm của Trung tâm KĐ và KN thuốc BVTV phía Bắc để làm tăng số l−ợng rầy lên cho đến thế hệ thứ 5, sau đó thì tiêu hủy toàn bộ.
ảnh 7: Các quần thể rầy nâu tự nhiên đ−ợc cách ly với nhau bằng các lồng chuyên dụng.
Đối với dòng rầy nâu mẫn cảm cũng đ−ợc nuôi trong lồng kính cho đến lúc rầy tr−ởng thành rộ tiến hành đ−a các khay mạ (10-14 ngày sau gieo) để lấy trứng. Sau đó các khay mạ này đ−ợc cách ly hoàn toàn với các nguồn rầy nâu khác cho đến khi có rầy nâu tr−ởng thành mới bắt đầu tiến hành thí nghiệm.
3.3.4 Xác định mức độ mẫn cảm của rầy nâu đối với một số thuốc trừ sâu
Chỉ tiêu: giá trị LD50 và LD95
Ph−ơng pháp xác định LD50 và LD95: Sử dụng ph−ơng pháp nhỏ giọt của T.S Matsumura đ5 đ−ợc IRRI công nhận để thử tính kháng thuốc của rầy nâu (Matsumura 2009) [50]. Việc đánh giá tiến hành trên rầy tr−ởng thành cái cánh dài từ thế hệ thứ nhất đến thế hệ thứ năm. Các b−ớc tiến hành nh− sau:
- Thuốc dùng để làm thí nghiệm trong phòng đều là thuốc kỹ thuật với hàm l−ợng hoạt chất từ 97% - 98%, mỗi 1 loại thuốc đ−ợc tính toán với độ lệch CF sao cho sau khi tính toán sẽ đ−ợc 1 l−ợng thuốc với 100% là hoạt chất cần để thử. Công thức tính CF nh− sau:
CF = 100% / % a.i của thuốc ban đầu.
Để chuẩn bị 1 l−ợng thuốc với hàm l−ợng là 10000 ppm trong 2,5 ml dung dịch aceton thì ta có công thức tính toán nh− sau:
L−ợng thuốc cần dùng = CF x 10000 àg/ml x 2,5 ml.
Sau khi đ5 có dung dịch mẹ thì chúng tôi tiến hành pha lo5ng ra 20 nồng độ với công thức C1V1 = C2V2
Trong đó: C1: nồng độ thuốc ở liều 1 C2: nồng độ thuốc ở liều 2
V1: thể tích liều thuốc 1 dùng để pha chế V2: thể tích liều thuốc 2 dùng để pha chế
ở đây chúng tôi tiến hành pha lo5ng nồng độ sau bằng 1/2 nồng độ tr−ớc. Sau khi pha lo5ng nồng độ bắt đầu tiến hành thử mức độ mẫn cảm của rầy nâu tr−ởng thành cánh dài. Đầu tiên chúng tôi tiến hành thử thăm dò: giai
đoạn này đ−ợc tiến hành với các nồng độ thuốc khác nhau để tìm ra thang với 5 – 6 nồng độ sao cho nồng độ cao nhất sẽ làm chết 90-95% số cá thể đ−ợc thử và nồng độ thấp nhất sẽ làm chết từ 5-15% số cá thể đ−ợc thử. Sau giai đoạn thí nghiệm này thang nồng độ đạt tiêu chuẩn trên sẽ đ−ợc chọn để dùng cho giai đoạn thí nghiệm chính thức.
Giai đoạn thí nghiệm chính thức: thang 5 nồng độ đ5 chọn đ−ợc dùng để thử cho rầy nâu cánh dài tr−ởng thành. Mỗi nồng độ nhắc lại 3 lần với mỗi lần nhắc lại số rầy nâu là 15 con. Rầy nâu tr−ởng thành sẽ đ−ợc gây mê bằng khí CO2 trong vòng 30s sau đó đ−ợc nhỏ thuốc bằng Microsyrine rồi thả rầy nâu đ5 đ−ợc xử lý thuốc vào trong hộp nhựa có mạ 10 - 14 ngày tuổi đ−ợc cuốn bông để theo dõi.
ảnh 9: Hộp nhựa dùng trong thí nghiệm.
Chọn 20 rầy nâu cái tr−ởng thành cánh dài đại diện cho mỗi quần thể sau đó rầy nâu đ−ợc gây mê bằng khí CO2 và đem cân để xác định trọng l−ợng trung bình của 1 cá thể rầy nâu.
Sau 24h xử lý thuốc tiến hành đếm số l−ợng rầy nâu chết trong từng lần nhắc lại. Số liệu về số l−ợng rầy nâu chết của từng lần nhắc lại, của mỗi công thức đ−ợc xử lý bằng ch−ơng trình Poloplus của IRRI để thu đ−ợc các giá trị LC50; LC95 và các chỉ số khác có liên quan.
Các chỉ số LD50; LD95 đ−ợc tính toán dựa trên l−ợng hoạt chất trong l−ợng thuốc đ−ợc nhỏ trên rầy, trọng l−ợng giọt thuốc nhỏ lên rầy và số cá thể rầy có trong 1 gam trọng l−ợng.
3.3.5 Hiệu lực của một số loại thuốc trừ sâu đới với rầy nâu ngoài đồng ruộng
Bố trí thí nghiệm trên đồng ruộng theo ph−ơng pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) với liều l−ợng khuyến cáo của các loại thuốc nghiên cứu. Mỗi công thức nhắc lại 4 lần.
Thuốc Liều l−ợng khuyến cáo Regent 800 WG 30 g/ha
Bassa 50 EC 1,5 l/ha Confidor 700 WG 80 g/ha
Chỉ tiêu điều tra: đếm số rầy nâu trong khay ở thời điểm tr−ớc phun và sau phun thuốc 1, 3, 7, 10 ngày
Ph−ơng pháp điều tra: Mỗi ô điều tra 5 điểm ngẫu nhiên, mỗi điểm 4 khóm, mỗi khóm dùng khay tráng dầu có kích th−ớc 20 cm x 20 cm đập 2 đập.
Thời điểm xử lý: Các thuốc đ−ợc phun khi rầy nâu tuổi nhỏ (1-2) với mật độ rầy cám khoảng 20 – 40 con/khóm.
Hiệu lực của thuốc với rầy nâu đ−ợc hiệu đính theo công thức Henderson Tilton:
Ta x Cb
H = (1 - ---) x100 Tb x Ca
Trong đó: Ta: số rầy nâu ở ô công thức sau khi xử lý thuốc Tb: số rầy nâu ở ô công thức tr−ớc khi xử lý thuốc Ca: số rầy nâu ở ô đối chứng sau khi xử lý thuốc Cb: số rầy nâu ở ô đối chứng tr−ớc khi xử lý thuốc.
Hiệu lực của các thuốc đ−ợc phân tích thống kê theo ph−ơng pháp đa biên độ Duncan bằng ch−ơng trình IRRISTAT 4.0.