và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối t−ợng, địa điểm nghiên cứu
Đối t−ợng và địa điểm nghiên cứu của đề tài là:
- Đàn lợn nái ngoại giống Yorkshire đang trong giai đoạn sinh sản nuôi tại trang trại Thu Thuỷ thuộc huyện Ch−ơng Mỹ – Hà Nội và trại Lạc Vệ thuộc huyện Thuận Thành - Bắc Ninh. đàn lợn đ−ợc nuôi d−ỡng , phòng bệnh theo đúng quy trình chăn nuôi lợn nái sinh sản.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Khảo sát, nghiên cứu ảnh h−ởng của một số yếu tố đến tỷ lệ mắc bệnh viêm đ−ờng sinh dục lợn nái Yorkshire.
3.2.2 Khảo sát, nghiên cứu ảnh h−ởng của một số yếu tố tới vị trí mắc bệnh trên đ−ờng sinh dục lợn nái Yorkshire.
3.2.3. Xét nghiệm vi khuẩn học trong dịch viêm đ−ờng sinh dục của lợn nái
+ Xác định thành phần và số l−ợng các loại vi khuẩn trong dịch đ−ờng sinh dục ở lợn nái sinh sản bình th−ờng và lợn nái bị mắc bệnh viêm đ−ờng sinh dục.
+ Làm kháng sinh đồ xác định tính mẫn cảm với các loại vi khuẩn có trong dịch viêm đ−ờng sinh dục.
3.2.4 Thử nghiệm phòng và điều trị bệnh viêm tử cung lợn nái. 3.3. Nguyên liệu nghiên cứu
3.3.1. Các môi tr−ờng nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
* Các môi tr−ờng phổ thông:
- Môi tr−ờng n−ớc thịt: dùng để nuôi cấy mẫu xét nghiệm ngay từ đầu. - Môi tr−ờng thạch th−ờng: dùng để kiểm tra khuẩn lạc và làm kháng sinh đồ.
* Các môi tr−ờng chuyên dụng dùng trong phân lập và giám định vi khuẩn
- Môi tr−ờng Sapman: dùng để phân lập và xác định độc lực của cầu khuẩn.
- Môi tr−ờng Brilliant Green agar: dùng để phân lập vi khuần E.coli và
Salmonella.
- Môi tr−ờng Edwards medium: dùng để phân lập vi khuẩn
Streptococcus.
- Môi tr−ờng thạch máu: dùng để giữ và bảo quản vi khuẩn
3.3.2 Giấy tẩm kháng sinh
- Các mảnh giấy chuẩn đ- đ−ợc tẩm kháng sinh theo đúng tiêu chuẩn Quốc tế do h-ng Oxoid (Anh) sản xuất.
- Các thuốc kháng sinh dùng để tẩm đều đạt tiêu chuẩn d−ợc điển Việt Nam 1994 do phòng quản lý thuốc thú y - Cục thú y Trung −ơng cung cấp.
- Với mỗi loại giấy tẩm kháng sinh lại có mức độ mẫn cảm và hàm l−ợng kháng sinh trong từng mảnh giấy khác nhau trong bảng d−ới đây:
Bảng 3.1. Bảng chuẩn đánh giá độ nhậy cảm của một số kháng sinh Tên thuốc Kháng sinh trong 1 mảnh giấy (àg) Kháng thuốc Φ (mm) Mẫn cảm TB Φ (mm) Rất mẫn cảm Φ (mm) Enrofloxacin 20 ≤ 16 17-22 ≥ 23 Tetracyclin 30 ≤ 14 15-18 ≥ 19 Amoxycillin 20 ≤ 13 14 - 16 ≥ 17 Gentamicin 10 ≤ 12 13 - 14 ≥ 15 Ampicillin 10 ≤ 11 12 - 13 ≥ 14 Trimethoprim 27,75/1,25 ≤ 10 11 - 15 ≥ 16 Kanamycin 30 ≤ 13 14-17 ≥ 18 Colistin 10 ≤ 8 9-10 ≥ 11 Penicillin 10UI ≤ 20 21-28 ≥ 29
3.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Xác định tỷ lệ lợn nái mắc bệnh viêm đ−ờng sinh dục bằng ph−ơng pháp điều tra, phỏng vấn trực tiếp quản lý kỹ thuật làm tại trại, kết hợp số liệu sổ sách thống kê của phòng kỹ thuật thú y tại các trại và theo dõi trực tiếp.
3.4.2 Phân loại viêm đ−ờng sinh dục (viêm đ−ờng sinh dục ngoài, viêm tử cung) theo ph−ơng pháp điều tra, sổ sách thống kê kết hợp theo dõi trực tiếp.
3.4.3 Lấy mẫu dịch tử cung của lợn bình th−ờng sau đẻ và lợn đang bị viêm tử cung làm xét nghiệm.
* Cách lấy mẫu dịch tử cung lợn để xét nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lấy mẫu dịch tử cung, âm đạo của lợn nái bình th−ờng sau đẻ 12 -24 giờ và lợn bị viêm tử cung, âm đạo. Phân lập giám định thành phần, số l−ợng vi khuẩn trên các môi tr−ờng chuyên dụng theo các ph−ơng pháp vi sinh vật th−ờng quy.
- Làm kháng sinh đồ theo ph−ơng pháp của Kirby - Bauer (1996) - Giấy tẩm kháng sinh do h-ng Oxoid (Anh) sản xuất.
- Đánh giá kết quả dựa theo tiêu chuẩn quốc tế 1996 (antibiotic susceptibility testing 1996)
+ Với lợn sau đẻ: dùng mỏ vịt (đ- đ−ợc sát trùng) để mở âm đạo sau đó lấy thìa sản khoa thu sản dịch tử cung cho vào ống nghiệm đ- đ−ợc vô trùng, mỗi lần lấy khoảng 3- 5 ml.
+ Với lợn bị viêm, dùng mỏ vịt (đ- đ−ợc sát trùng) mở âm đạo, sau đó lấy thìa sản khoa thu dịch tử cung cho vào ống nghiệm đ- đ−ợc vô trùng, mỗi lần lấy khoảng 3-5 ml.
* Bảo quản và xử lý mẫu
- Các mẫu dịch thí nghiệm sau khi lấy đựơc giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 – 8oC trong vòng 24 giờ, đ−a đến phòng xét nghiệm và tiến hành kiểm tra
theo ph−ơng pháp nghiên cứu vi khuẩn học của tác giả Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, (1978)[15] ; Phạm Kim Anh, Nguyễn Văn Quỳnh (1991)[1]; Nguyễn Văn Quỳnh, (1991)[16]
- Để có thể đếm đ−ợc số khuẩn lạc trên môi tr−ờng thạch th−ờng, tuỳ theo số vi khuẩn có trong bệnh phẩm. Mẫu xét nghiệm cần phải pha lo-ng đến mức độ cần thiết. Sau nhiều lần cấy mẫu với các độ pha lo-ng khác nhau, chúng tôi đ- xác định đựơc độ pha lo-ng thích hợp với các bệnh phẩm nh− sau:
+ Dịch tử cung lợn sau đẻ là: 10-4 + Dịch tử cung lợn bệnh lý là: 10-7
- Đếm tổng số khuẩn lạc trên 1 đĩa thạch và quy đổi trong 1ml dịch tử cung. - Sau khi pha lo-ng, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn vào thạch đĩa. Mỗi mẫu xét nghiệm đ−ợc đ−a vào 2 đĩa thạch th−ờng và đĩa thạch phân lập, mỗi đĩa thạch đ−ợc cấy 0,1 ml dịch và đánh số. Tất cả đ−ợc bồi d−ỡng trong tủ ấm 37oC/24 giờ. Sau đó đếm số khuẩn lạc có trong các đĩa ở môi tr−ờng thạch th−ờng và thạch chuyên dụng. Số vi khuẩn có trong 1 ml dịch mẫu đ−ợc tính theo công thức:
X= 10.A.N
Trong đó: X: số khuẩn lạc trong 1ml dịch.
A: số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa. N: độ pha lo-ng.
- Để đếm đ−ợc tổng số các loại vi khuẩn có trong dịch nghiên cứu, tr−ớc tiên chúng tôi dùng môi tr−ờng thạch th−ờng để đếm tổng số các loại vi khuẩn có trong một đĩa thạch ở độ pha lo-ng thích hợp. Đồng thời, chúng tôi còn sử dụng các môi tr−ờng chuyên dụng sau để đếm các loại vi khuẩn có mặt chủ yếu ở tử cung lợn khi bị viêm:
+ Môi tr−ờng Sapman dùng đếm vi khuẩn Staphylococcus.
+ Môi tr−ờng Edwards medium dùng đếm vi khuẩn Streptococcus.
+ Môi tr−ờng Brilliant green-agar dùng đếm vi khuẩn E.coli và Salmonella
tổng số khuẩn lạc có trên đĩa thạch th−ờng ở cùng một nồng độ pha lo-ng.
3.4.4. Ph−ơng pháp xác định số loại và số l−ợng vi khuẩn
- Các đĩa thạch th−ờng sau khi đ- ria cấy vi khuẩn, bồi d−ỡng trong tủ ấm 37oC/24 giờ, lấy ra quan sát hình thái, kích th−ớc và dạng khuẩn lạc. Từ đó sơ bộ định loại vi khuẩn.
- Mỗi loại vi khuẩn, khi mọc trên môi tr−ờng có thể sẽ hình thành một loại khuẩn lạc có kích th−ớc, hình dáng và màu sắc riêng biệt nh−:
+ Staphylococcus: khuẩn lạc dạng S, rìa gọn, tròn, mặt lồi, láng bóng có màu vàng rơm (nếu là Staphylococcus aureus).
+ Streptococcus: khuẩn lạc dạng S, nhỏ, mầu hơi xám, bóng.
+ Salmonella: khuẩn lạc dạng S, có thể có khuẩn lạc dạng R, khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa.
+ E.coli: khuẩn lạc dạng S, có thể có dạng R, khuẩn lạc tròn, không trong suốt, mầu tro, trắng nhạt, hơi lồi.
- Sau khi xác định đựơc các loại khuẩn lạc khác nhau, mỗi loại khuẩn lạc lại tiến hành phiết kính, nhuộm gram để xem hình thái, tính chất bắt màu và cấu trúc đặc biệt của vi khuẩn nh−:
+ Staphylococcus: bắt màu (Gr+), hình cầu, tụ lại hình chùm nho.
+ Streptococcus: bắt màu (Gr+), có hình cầu hoặc hình trứng, đứng riêng lẻ hoặc chuỗi.
+ E.coli: bắt màu (Gr-), là trực khuẩn hình gậy, ngắn; bắt mầu thẫm ở hai đầu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Salmonella: bắt mầu (Gr-), là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn. - Khuẩn lạc đ- đ−ợc tách thuần khiết, cấy vào các môi tr−ờng phân lập, để xác định tính chất mọc của chúng trong các môi tr−ờng này.
+ Môi tr−ờng Sapman: Staphylococcus khuẩn lạc to, rìa gọn. Nếu là tụ cầu gây bệnh thì môi tr−ờng biến thành màu vàng, tụ cầu không gây bệnh thì môi tr−ờng giữ nguyên màu đỏ.
mịn, rìa gọn.
+ Môi tr−ờng Brilliant: E.coli làm môi tr−ờng biến màu vàng chanh.
Salmonella làm môi tr−ờng có màu đỏ.
- Cuối cùng cấy chuyển thạch máu giữ giống để giám định tiếp nếu có thể. Toàn bộ quy trình thí nghiệm, xác định số l−ợng, số loại, phân lập vi khuẩn có trong dịch tử cung lợn bình th−ờng, bệnh lý rồi đ−ợc kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh và thuốc hoá học trị liệu từ đó đ−a ra phác đồ điều trị.
3.4.5. Xác định độ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc từ dịch tử cung lợn với các thuốc hoá học trị liệu bằng ph−ơng pháp làm kháng sinh đồ
- Tiến hành làm kháng sinh đồ theo ph−ơng pháp khuếch tán trên thạch của Kirby – Bauer.
- Ph−ơng pháp chỉ dùng canh trùng nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC trong 24 giờ, ria cấy trên mặt thạch. Để đĩa thạch từ 3 đến 5 phút cho khô, nh−ng không quá 25 phút. Sau đó dùng panh vô trùng đặt các mảnh giấy kháng sinh tiếp xúc đều với mặt thạch. Các mảnh giấy kháng sinh đặt cách nhau không d−ới 24 mm.
- Sau khi đặt các mảnh giấy vào đĩa thạch đ−ợc khoảng 15 phút, đặt đĩa thạch vào tủ ấm 37oC, sau 16 - 18 giờ lấy ra đọc kết quả. Kết quả đ−ợc đọc bằng cách dùng th−ớc ấm để đo đ−ờng kính của vòng vô khuẩn, đo phía sau mặt đĩa thạch. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải đo chỗ hẹp nhất và chỗ rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình. Đ−ờng kính của vòng vô khuẩn đựơc tính ra mm. Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại.
- Kết quả kháng sinh đồ chỉ đ−ợc ứng dụng điều trị với vi khuẩn còn mẫn cảm với thuốc kháng sinh, còn khi vi khuẩn đ- kháng thuốc tức vòng vô khuẩn d−ới mức diệt khuẩn thì không đ−ợc dùng.
trung bình. Khi vi khuẩn mẫn cảm ở mức trung bình thì thuốc điều trị đ- chọn phải dùng ở liều cao hơn, hoặc bơm thẳng vào vị trí đang bị bệnh trong cơ thể (bơm vào tử cung).
- Vi khuẩn kháng thuốc, tuyệt đối không dùng thuốc đ- bị kháng để điều trị bệnh.
3.4.6 Xây dựng quy trình thử nghiệm phòng bệnh viêm tử cung
B−ớc 1: Công tác nuôi d−ỡng, chăm sóc
- Vệ sinh chuồng nuôi, cơ thể lợn nái, lợn đực đặc biệt là bộ phận sinh dục khi phối giống, tr−ớc và sau đẻ sạch sẽ. - Đảm bảo lợn đực, lợn nái không mắc bệnh truyền nhiễm khi phối giống
- Tinh dịch dùng trong thụ tinh nhân tạo đảm bảo không nhiễm khuẩn v−ợt quá mức cho phép.
- Đảm bảo dinh d−ỡng cho lợn nái tr−ớc và sau khi sinh. - Thực hiện khâu phối giống, đỡ đẻ đúng kỹ thuật đảm bảo vệ sinh.
- Cho lợn uống n−ớc sạch.
B−ớc 2: Công tác thú y
- Định kỳ trộn thuốc kháng sinh Amoxycillin vào thức ăn cho lợn nái 1 tháng trộn 3 ngày.
- Phun thuốc sát trùng định kỳ 01 tuần 1 lần
- Tiêm Terramycin*/LA cho nái với liều 1ml/10kg thể trọng 1h tr−ớc khi sinh.
- Ngay sau khi lợn nái đẻ tiêm Oxytocin với liều 1ml/con, Dexamethasone với liều 1ml/con.
- Ngày thứ 2 sau khi lợn nái đẻ tiêm bắp kháng sinh Terramycin*/LA 1ml/10kg P
* Trong quy trình phòng bệnh thử nghiệm:
+ Vệ sinh chuồng nuôi là một việc làm rất cần thiết và quan trọng vì hàng ngày lợn nái tiếp xúc với môi tr−ờng trong chuồng nuôi: rửa máng ăn hàng ngày, dọn phân liên tục, rửa chuồng 2 ngày một lần, định kỳ quét màng nhện và bụi bẩn trên t−ờng, trần..., Vệ sinh cơ thể lợn nái, lợn đực , khi khai thác tinh, khi phối giống, đặc biệt là vệ sinh bộ phận sinh dục lợn nái tr−ớc và
sau đẻ sạch sẽ là rất quan trọng vì bình th−ờng cổ tử cung luôn đóng nh−ng trong thời gian sinh đẻ cổ tử cung mở, vi khuẩn có điều kiện xâm nhập để gây bệnh. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, đây là một trong những nguyên nhân dẫn tới tỷ lệ lợn nái đẻ mắc bệnh viêm đ−ờng sinh dục tăng cao.
+ Đảm bảo dinh d−ỡng cho lợn nái tr−ớc và sau khi đẻ sẽ góp phần nâng cao sức đề kháng cho cơ thể lợn nái.
+ Trong kỹ thuật thụ tinh nhân tạo cần thực hiện đúng quy trình vệ sinh khai thác tinh, n−ớc và dụng cụ pha tinh, dụng cụ phối, vệ sinh bộ phận sinh dục con nái, đ−a dụng cụ phối khéo léo không làm xây x−ớc niêm mạc tử cung, không để lợn chạy...Trong phối giống trực tiếp ngoài vấn đề vệ sinh con đực, con cái cần quan tâm đến sự chênh lệnh thể vóc. Khi lợn đẻ nếu ng−ời đỡ đẻ không vô trùng tay, dụng cụ, đỡ đẻ không đũng kỹ thuật, sẽ mang mầm bệnh vào đ−ờng sinh dục, làm xây xát niêm mạc đ−ờng sinh dục dẫn tới viêm đ−ờng sinh dục. Thực hiện tốt việc để lợn nái đẻ tự nhiên, không can thiệp bằng tay (dùng tay móc thai ra), trừ tr−ờng hợp đẻ khó, sẽ hạn chế đ−ợc viêm đ−ờng sinh dục sau đẻ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Cho lợn uống n−ớc sạch để phòng bệnh đ−ờng tiết niệu, tiêu hoá vì theo các nghiên cứu gần đây cho thấy, vi khuẩn từ đ−ờng tiết niệu có thể xâm nhập vào âm đạo, tử cung gây viêm nhiễm.
+ Định kỳ trộn thuốc kháng sinh Amoxyllin một tháng một lần để phòng bệnh các vi khuẩn có mặt trong cơ thể lợn nái nhân lên.
+ Định kỳ phun thuốc sát trùng một tuần một lần để hạn chế số l−ợng vi khuẩn có mặt trong môi tr−ờng chuồng nuôi.
+ Tiêm Terramycin*/LA cho nái với liều 1ml/10kg thể trọng 1h tr−ớc khi sinh nhằm ngăn chặn các loại vi khuẩn cơ hội gây bệnh. Terramycin*/LA có chứa Oxytetracycline, đ−ợc bào chế d−ới dạng dung dịch, thời gian duy trì thuốc kéo dài trong 3 ngày, thuốc có khả năng khuếch tán rộng, ngăn chặn đ−ợc hầu hết các loại vi khuẩn (vi khuẩn Gram (+), Gram (-), nên phòng
bệnh viêm đ−ờng sinh dục rất tốt.
+ Oxytocin là một chế phẩm có tác dụng tạo ra các cơn co bóp nhằm đẩy nhanh dịch sau đẻ và chất bẩn ra ngoài. Vì vậy, hạn chế đ−ợc viêm đ−ờng sinh dục và thúc đẩy gia súc nhanh chóng động dục trở lại sau cai sữa.
+ Dexamethasone có tác dụng chống viêm, giảm phù nề.
+ Ngày thứ 2 sau khi lợn nái đẻ tiêm bổ sung một mũi Terramycin*/LA cho nái với liều 1ml/10kg thể trọng để tăng nồng độ kháng sinh trong cơ thể lợn nái chống nhiễm bệnh kế phát.
3.4.7. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh viêmnội mạc tử cung tử cung - Xác định phác đồ điều trị bệnh hữu hiệu qua theo dõi tỷ lệ khỏi bệnh, khả năng sinh sản của những lợn nái sau khi đ−ợc điều trị lành bệnh
*Phác đồ 1:
Dùng kháng sinh Amoxyllin L.A 10% tiêm bắp với liều 1ml/10kg trọng l−ợng. Ngày tiêm một lần, cách ngày 1 lần. Liệu trình 3 lần.
Thụt đung dịch Lugol 0.1% 1 lần 1 ngày từ 200-500ml đến khi hết dịch. Liệu trình 1-3 ngày.
Oxytoxin tiêm bắp ngày 1 lần để đẩy dịch viêm ra ngoài. Liệu trình 2 ngày Dexamethasone tiêm bắp với liều 1ml/20 kg trọng l−ợng. Liệu trình 3 ngày
*Phác đồ 2:
Dùng kháng sinh Enrofloxacine 10% tiêm bắp với liều 1ml/10kg trọng l−ợng. Ngày tiêm một lần, Liệu trình 3 ngày.