ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1 Địa điểm nghiên cứu
+ Phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh cây, Tr−ờng Đại học Nông nghiệp - Hà Nội.
+ Một số v−ờn trồng cây có múi tại Công ty cây ăn quả 19/5, Nông tr−ờng Xuân thành, Nông Tr−ờng Cờ đỏ, Nông tr−ờng 1/5.
- Thời gian thực tập: từ 1/1/2009 đến 30/6/2009.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
- Các giống cam trồng tại các cơ sở trên. + Tuổi cây từ 1 đến 8 năm tuổi.
+ Trên các giông cam thí nghiệm: Cam Sông con, cam Valencia, cam Vân Du. - Môi tr−ờng nuôi cấy: WA, PDA, PCA, Czapeck.
- Mẫu bệnh hại là mẫu bệnh thu nhập ngoài đồng ruộng, mẫu bệnh con t−ơi mới, có vết bệnh điển hình.
- Các dụng cụ thiết yếu trong phòng khí nghiệm: Hộp petri, que cây nấm khuẩn, tủ định ôn, phòng nuôi cây nấm khuẩn, tủ định ổn, phòng nuôi cây nấm, các loại cố thuỷ tinh, ống đong, bình đựng mức, nồi hấp, tủ lạnh, kính hiểm vi quang học..v.v..
3.3 Nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Điều tra thành phần bệnh hại cây cam
3.3.1.1 Ph−ơng pháp điều tra
- Điều tra theo ph−ơng pháp nghiên cứu BVTV (Đặng Vũ Thị Thanh, Hà Minh Trung, Viện bảo vệ thực vật, 1999).
+ Điều tra mỗi v−ờn 5 điểm, mỗi điểm 3 cây, mỗi cây điều tra theo bốn h−ớng Đông, Tây, Nam, Bắc, mỗi h−ớng một cành, mỗi cành điều tra 30 lá ngẫu nhiên.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………23
+ Quan sát triệu chứng bệnh trên cây có múi tại các cơ sở trên, đánh giá mức độ phổ biến của bệnh trên ruộng điều tra.
+ Phân cấp bệnh trên lá (thân, quả): + < 10% số cây bị bệnh ++ 10% - 25% số cây bị bệnh +++ >25% - 50% số cây bị bệnh
3.3.1.2 Ph−ơng pháp điều tra diễn biến bệnh
Điều tra định kỳ 15 ngày 1 lần, theo ph−ơng pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm lấy 3 cây, mỗi cây điều tra theo bốn h−ớng Đông, Tây, Nam, Bắc, mỗi h−ớng lấy một cành, mỗi cành lấy 30 lá ngẫu nhiên.
3.3.2 Đánh giá một số yếu tố ảnh h−ởng sự phát sinh, phát triển của bệnh thán th−
3.3.2.1 ảnh h−ởng của các yếu tố sinh thái đến sự phát triển bệnh thán th− hại cam
-Điều tra trên các v−ờn trồng cam quýt ở Công ty cây ăn quả 19/5,Nông tr−ờng xuân thành, Nông tr−ờng 3/2, Nông tr−ờng 1/5.
- Giống điều tra: Cam Vân Du
-Thu thập số liệu khí t−ợng vùng Phủ Quỳ, Nghệ An
3.3.2.2 ảnh h−ởng của h−ớng cây, tầng lá đến sự phát triển của bệnh thán th− trên giống cam
- Giống điều tra: Cam Vân Du
3.3.2.3 Mức độ hại bệnh của thán th− ở một số vùng trồng cây cam quýt
- Điểm điều tra trên các v−ờn trồng cam quýt ở Công ty cây ăn quả 19/5, Nông tr−ờng xuân thành, Nông tr−ờng 3/2, Nông tr−ờng 1/5.
- Giống điều tra: Cam sông con, cam valencia, cam Vân Du, quýt PQ1
3.3.2.4 ảnh h−ởng của giống và loại cây có múi đến bệnh thán th− (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Giống thí nghiệm: - Mỗi công thức 15 cây
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………24
3.3.2.5 ảnh h−ởng của tuổi cây đến bệnh thán th−
- Giống thí nghiệm: Cam Vân Du, ở các độ tuổi 1 năm đến 6 năm - Mỗi công thức 15 cây
- Chỉ tiêu theo dõi: TLB % và CSB % qua các thời kỳ điều tra.
3.3.2.6 ảnh h−ởng của mật độ trồng đến bệnh thán th−
- Thí nghiệm với hai công thức
+ Công thức 1: Mật độ trồng (4x5m) + Công thức 2: Mật độ trồng (3 x 3 m) - Giống thí nghiệm Cam Vân Du
- Mỗi công thức 15 cây
- Chỉ tiêu theo dõi: TLB % và CSB % qua các thời kỳ điều tra.
3.3.2.7 ảnh h−ởng của biện pháp làm cỏ đối với bệnh thán th−
- Thí nghiệm với hai công thức + Công thức 1: Làm cỏ
+ Công thức 2: Không làm cỏ Giống thí nghiệm là Cam Vân Du Mỗi công thức 15 cây.
Chỉ tiêu theo dõi: TLB % và CSB % qua các thời kỳ điều tra
3.3.2.8 ảnh h−ởng của liều l−ợng đạm đến bệnh thán th−
- Thí nghiệm với hai công thức
Công thức 1: L−ợng đạm urê là 350 kg /ha. Công thức 2: L−ợng đạm urê là 250kg/ha.
Giống thí nghiệm Cam sông con, mỗi công thức 15 cây. Chỉ tiêu theo dõi: TLB % và CSB % qua các thời kỳ điều tra
3.3.2.9 ảnh h−ởng của thuốc hoá học đến bệnh thán th−
- Thí nghiệm với bốn loại thuốc là Ridomil MZ 72 BHN, Aliette 80WP, Champion 77WP, oxyclorua đồng 30 WP
Giống thí nghiệm là cam Vân Du, Có 5 công thức mỗi công thức 15 cây,nhắc lại 3 lần
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………25
+ Công thức 1: thuốc Ridomil MZ 72 BHN 0.3% + Công thức 2: thuốc Aliette 80 WP 0,3%
+ Công thức 3: thuốc Champion 77WP 0.3% + Công thức 4: thuốc oxyclorua đồng 30 WP 0.7% + Công thức 5: đối chứng không phun thuốc
- Thuốc đ−ợc phun bằng bình bơm tay 10 lít của Công ty vật t− Bảo vệ thực vật 1, điều tra bệnh hại tr−ớc khi phun 1 ngày và điều tra sau khi phun 5 ngày, 7 ngày, 14 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: TLB % và CSB % qua các thời kỳ điều tra
3.4 Ph−ơng pháp nghiên cứu bệnh hại trong phòng
3.4.1 Mô tả đặc điểm của bệnh thán th− hại cây cam
Thu thập mẩu bệnh lá, cành, hoa, bị bệnh thán th− ngẩu nhiên trên đồng ruộng đ−a về phòng phân tích, mô tả đặc điểm triệu chứng,so sánh với một số bệnh hại khác. Đối với cành thu thập số l−ợng 200 cành sau đó tiến hành phân loại các nhóm theo các mức sau:
+ Chiều dài cành - Nhóm I : 0-10 cm - Nhóm II: 10-20 cm - Nhóm III: 20-30 cm - Nhóm IV: 30-40 cm - Nhóm V: > 40 cm + Đ−ờng kính cành - Nhóm I: 2-4mm - Nhóm II: 4-6mm - Nhóm III: 6-10mm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.2 Phân lập và nuôi cấy nấm Colletotrichum gloeosporioides trên các môi tr−ờng nhân tạo
3.4.2.1 Ph−ơng pháp để ẩm
Sau khi điều tra thu thập mẫu bệnh (lá, thân, cành, quả) ngoài đồng ruộng chúng tôi chọn mâu bệnh có triệu chứng điển hình rửa sách đất cát, cắt
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………26
thành mẫu thích hợp để trong hôpk Petri có lót giấy ẩm, để ở nhiệt độ thích hợp sau 2- 3 ngày có độ ẩm th−ờng xuyên, đem kiểm tra d−ới kính hiểm vi để xác định sơ bộ tác nhân gây bệnh.
3.4.2.2 Ph−ơng pháp điều chế môi tr−ờng
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các loại môi tr−ờng nhân tạo PDA, PCA, Czapeck, WA.
* Môi tr−ờng PDA Thành phần
+ Khoai tây: 200gram + Agar: 20 gram + Đ −ờng glucose: 20gram + N−ớc cất: 1000 ml
Điều chế môi tr−ờng: Khoai tây gọt sạch vỏ, thát lát mỏng, đem đun sôi với n−ớc cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. N−ớc lọc cho thêm n−ớc cất đủ 1000 ml đem đun sôi lại.
Cho vào lần l−ợt, Agar khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ môi tr−ờng vào bình tam giác, hay ống nghiệm có đậy nút giây bạc (Bình tam giác, ống nghiệm, hộp petri đ1 đ−ợc rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1800C trong hai giờ). Sau đó đem khử trùng trong nồi hấp áp suất 1,5 atm (1210C) trong 30 phút.
Môi tr−ờng đ1 khử trùng dùng để phân lập hoặc nuôi cấy nấm, có thể bảo quản trong tủ lạnh.
* Môi tr−ờng PCA Thành phần:
+ Khoai tây: 15gram + Agar: 20 gram + Cà rốt: 10gram + N−ớc cất: 1000ml
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………27 * Môi tr−ờng Czapeck Thành phần + Saccarose: 20gram + NaNO3: 1gram + MgSO4: 0,5gram + FeCl3: 0,01 gram + KCl: 0,5 gram + Agar: 20gram + N−ớc cất: 1000ml
Cách điều chế : Đong đủ 1000ml n−ớc cất đem đun sôi, rồi cho lần l−ợt các hoá chất đ1 đ−ợc cân đủ l−ợng vào, khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ môi tr−ờng vào bình tam giác hay ống nghiệm có đậy nút gấy bạc (bình tam giác, ống nghiệm, hộp petri đ1 đ−ợc rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1080C trong hai giờ). Rồi đem khử trùng trong nồi hấp, cách khử trùng t−ơng tự trong môi tr−ờng PDA
* Môi tr−ờng WA Thành phần:
+ Agar 20gram + N−ớc cất: 1000ml
Cách điều chế : Đun tan Agar trong n−ớc cất sau đó khử trùng. Cách làm t−ơng tự các môi tr−ờng trên.
3.4.2.3 Ph−ơng pháp phân lập
Mẫu bệnh điển hình t−ơi mới ngoài đồng ruộng chúng tôi đem về phân lập và nuôi cấy trên các môi tr−ờng nhân tạo trong phòng thí nhiệm để tạo đ−ợc nguồn nấm thuần khiết (Isolate) làm vật liệu nghiên cứu.
- Các phân lập mẫu bệnh:
+ Bệnh phân lập lấy từ các vết trên lá (thân, cành, quả) có triệu chứng điển hình còn t−ơi mới đ−a về phòng thí nghiệm rửa sạch đất bụi bằng n−ớc
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………28
máy. Dùng dao đ1 khử trùng miếng cắt (0,2 - 0,3) miếng cắt có phần mô khoẻ và mô bệnh sau đó khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1 % trong 1 phút tiếp tục rửa sạch bằng n−ớc cất 2 đến 3 lần, rồi thấm khô bằng giấy lọc vô trùng. Dùng que cấy khử trùng (dùng cồn đốt lên ngọn lửa) để nguội cấy mô lên môi tr−ờng nhân tạo.
Sau khi nấm mọc tiến hành cắt đầu sợi nấm cấy truyền sang các ống nghiệm khác từ 4 - 5 ống cho khi thu đ−ợc nguồn nấm thuần khiết (Isolate). Quan sát đặc điểm hình thái, màu sắc sợi nấm. Khi đ1 có nấm, tản nấm và bào tử phân sinh, cành bào tử và các cấu trúc của nấm. Khi đ1 có nấm thuần khiết, tiến hành các thí nhiệm trong phòng.
3.4.3 Xác định nguyên nhân gây bệnh thán th− trên cam
Sau khi đ1 tạo đ−ợc nguồn nấm thuần khiết (Isolate), chúng tôi tiến hành các thí nhiệm lây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng.
- Từ các cây bị nhiễm bệnh nhân tạo hình thành triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành phân lập lại mô bệnh trên môi tr−ờng nhân tạo (theo quy tắc Koch).
- Miêu tả, so sánh đặc điểm và hình thái và màu sắc của sợi nấm, tản nấm, đĩa cảnh, kích th−ớc đĩa cành và bào tử nấm gây bệnh thán th− trên cây cam Vân du và nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán th− trên cam, quýt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dựa vào các đặc điểm về hình dạng, màu sắc kích th−ớc bào tử, đĩa cành, sợi nấm và tản nấm để xác định loài nấm gây bệnh thán th− trên cây cam Vân du, (căn cứ vào các tài liệu phân loại của Barnett và hunter (1998). 3.4.4 Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo bệnh thán th− hại cam Colletotrichum
gloeosporioides
Ph−ơng pháp: Tr−ớc khi lây, tiến hành cắt bông thành những miếng nhỏ (kích th−ớc 30 x 50 mm) đặt lên băng dính. Sau đó tạo dung dịch bào tử trong n−ớc cất vô trùng đảm bảo nồng độ 10000 bào tử /ml . Tiếp theo dùng kim nhọn sát th−ơng nhẹ tại điểm cần lây rồi phun hoặc nhỏ dung dịch bào tử lên bề mặt sát th−ơng, ngay sau đó dán miếng bông đ1 thấm n−ớc cất vô trùng vào
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………29
vị trí lây. Với lây không sát th−ơng chúng tôi tiến hành các b−ớc t−ơng tự nh−ng không tạo nên vết th−ơng cơ giới.
Chỉ tiêu theo dõi: số lá (quả) lây bệnh, số lá (quả) phát bệnh, ngày lây bệnh, ngày phát bệnh, tính TLB % và thời kỳ tiềm dục (ngày).
Mỗi công thức lây 20 lá
Công thức đối chứng: 20 lá lây bằng n−ớc cất vô trùng.
3.4.5 ảnh h−ởng của các môi tr−ờng nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides
- Sử dụng các nguồn nấm thán th− thuần khiết (isolate). Cấy nấm vào giữa hộp peri (đ−ờng kính lỗ đục 5mm) trên các môi tr−ờng PCA, PDA, Czapeck.
Mỗi môi tr−ờng có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại có 03 hộp peri. Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hình thái, màu sắc tản nấm.
+ Đo đ−ờng kính tản nấm (mm) sau cấy 2, 4, 6, 8 ngày.Tính sự phát triển của tản nấm (%) trên diện tích hộp petri đ−ờng kính 90 mm
3.4.6 ảnh h−ởng của các môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau đến kích th−ớc bào tử Colletotrichum gloeosporioides
Dùng nguồn nấm thuần khiết (Isolate), cấy vào giữa các hộp petri có chứa các môi tr−ờng khác nhau (đ−ờng kính lỗ đục 5 mm).
+ Công thức 1: Môi tr−ờng PCA + Công thức 2: Môi tr−ờng PDA + Công thức 3: Môi tr−ờng Cazpeck
Mỗi công thức có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri.
Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian xuất hiện bào tử nấm (ngày), đo chiều dài, chiều rộng của các bào tử, mỗi công thức đo 100 bào tử, đơn vị đo: àm
+ Công thức tính : Chiều dài (rộng) của bào tử = a x 1,2 (àm) A = chiều dài (rộng) đo đ−ợc bằng th−ớc đo của trắc vị thị kính.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………30
3.4.7 ảnh h−ởng của môi tr−ờng nuôi cấy đến sự hình thành bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm bằng nguồn nấm Colletotrichum gloeosporioides thuần khiết (Isolate), cấy vào các hộp petri (đ−ờng kính lỗ đục 5 mm) với các môi tr−ờng khác nhau.
+ Công thức 1: Môi tr−ờng PCA + Công thức 2: Môi tr−ờng PDA + Công thức 3: Môi tr−ờng Cazpeck
Mỗi công thức có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 03 hộp peri. Chỉ tiêu theo dõi:
+ Đếm mật độ bào tử trên các môi tr−ờng khác nhau sau 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày cấy ( bào tử /ml)
3.4.8 ảnh h−ởng của ánh sáng đến sự sự phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm bằng nguồn nấm Colletotrichum gloeosporioides thuần khiết (Isolate), cấy vào các hộp petri (đ−ờng kính lỗ đục 5mm) trên môi tr−ờng PDA.
+ Công thức 1: Tối hoàn toàn
+ Công thức 2: 1/2 ánh sáng + 1/2 tối. Một công thức có ba lần nhắc lại, mỗi lân chỉ tiêu theo dõi: nhắc lại 3 hộp petri.
+ Đo kích th−ớc của tản nấm sau cây 2, 4, 6, 8 ngày mặt độ bao tử sau 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày cây. Tính sự phát triển của tản nấm (%) trên diện tích hộp petri đ−ờng kính 90 mm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………31
3.4.9 ảnh h−ởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Colletotrichum gloeosporioides
Chúng tôi sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Ioslate) đ1 phân lập đ−ợc (lỗ đục5 mm), cây vào giữa các hộp petri có chúa môi tr−ờng PDA. Sau khi cấy, các hộp petri đ−ơc đặt ở các mức nhiệt độ khác nhau (tủ lạnh và tủ định ổn, tủ nuôi cây).
Các ng−ỡng nhiệt độ thí nghiệm: 150C, 200C, 250C, 300C, 350C.
Mỗi ng−ỡng nhiệt độ có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại có 3 hộp petri. chỉ tiêu theo dõi:
+ Đo đ−ờng kính tảm nấm sau 2, 4, 6, 8, ngày cấy (đơn vị đo: mm).Tính sự phát triển của tản nấm (%) trên diện tích hộp petri đ−ờng kính 90 mm 3.4.10 ảnh h−ởng của pH môi tr−ờng đến sự phát triển của nấm
Colletotrichum gloeosporioides
Dùng NaOH hoặc axit HCl để điều chỉnh pH của môi tr−ờng PDA có các ngững pH khác nhau từ pH4 đến pH 8. + Công thức 1: pH 4 + Công thức 2: pH 5 + Công thức 3: pH 6 + Công thức 4: pH 7 + Công thức 5: pH 8
Cấy nguồn nấm thuần thiết (lsolate) với đ−ờng kính lỗ đục 5mm vào giữa các hộp petri có chứa môi tr−ờng PDA, với các ng−ỡng pH khác nhau.
Mỗi công thức có ba lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri. Chỉ tiêu theo dõi:
+ Đo đ−ờng kính tản nấm sau 2, 4, 6, 8 ngày. Tính sự phát triển của tản nấm (%) trên diện tích hộp petri đ−ờng kính 90 mm