2 .3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
2.2.4.2 Đánh giá hoạt tính kháng ung thư
(Thực hiện tại Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Hoá học các Hợp chất Thiên Nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Phương pháp thực hiện
Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ
(NCI) và trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Các dòng tế bào thử nghiệm:
- Hep-G2 (Heptatocellular carcinoma – ung thư gan).
- Lu (Lung cancer – ung thư phổi).
- RD (Rhabdosarcoma - ung thư màng tim ).
Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt). Có bổ xung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum), Tripsin- EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.
Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…
Chất chuẩn chứng dương tính:
Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO.
Mật độ quang được đo trên máy ELISA ở bước sóng 495-515 nm.
Tính kết quả:
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử
tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo công thức:
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100 OD (DMSO) – OD (ngày 0)
Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel
để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ
Σ (xi - x )2 σ = n - 1 Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽđược chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50 : dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang gía trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ
chất thửđể tính giá trị IC50. Công thức: 1/y=a+blnX Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%).
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập cur
3.1.1 Kết tinh curcuminoid
Bảng 3.1: Kết quả kết tinh bột curcuminoid Lượng dung môi
(ml) Hiệu suất (%) STT Lần kết tinh CH3OH H2O Khối lượng trước kết tinh (g) Khối lượng sau kết tinh (g) Riêng Tổng cộng 1 45 8 0,5001 0,3402 68,02 2 34 9 0,3420 0,2623 76,69 1 3 25 5 0,2623 0,2019 76,97 40,37 1 50 10 0,5012 0,3321 66,26 2 36 8 0,3321 0,2501 75,30 2 3 27 6 0.2501 0,2134 85,32 4 42,57 1 48 8 0.5026 0,3503 69,69 2 33 8 0,3503 0,2712 77,41 3 3 25 7 0,2712 0,2246 82,81 44,68
Hình 3.1: TLC kiểm tra hỗn hợp curcuminoid sau các lần kết tinh
Chú thích
M: mẫu chưa kết tinh I: kết tinh lần 1 II: kết tinh lần 2 III: kết tinh lần 3 1: Cur 2: DMC 3: BDMC 4: Nhựa
Nhận xét:
Qua kết quả bảng định lượng cho quá trình kết tinh cho thấy hiệu suất của từng lần kết tinh tương đối cao vào khoảng 68-84%. Nhưng hiệu suất cuối cùng qua 3 lần kết tinh lại không cao vào khoảng 40-44%.
Qua khảo sát TLC hệ dung môi diclometan:metanol (98:2) cho thấy nhờ quá trình kết tinh mà ta đã loại bỏ được phần lớn nhựa, DMC, BDMC góp phần làm tăng đáng kể hàm lượng cur.
Vậy từ 1,539g bột curcuminoid thương phẩm qua 3 lần kết tinh thu được 0,6399g cur thô và hiệu suất trung bình cả 3 lần kết tinh là 42,54%.
3.1.2 Sắc ký cột phân lập cur - Khối lượng mẫu nạp cột m0 = 1 g 4 3 2 1
- Dung môi rửa giải diclometan:eter dầu hỏa (90:10)
Lượng silica gel nạp vào cột m = 50g, chiều cao tương ứng của silica gel trong cột là 19cm.
Đường kính trong của cột: 3cm
Hình 3.2: Sắc ký cột phân lập cur Hình 3.3: TLC phân đoạn tinh từ SKC a) Ngoài ánh sáng 1: Hỗn hợp curcumonoid ban đầu
b) Dưới đèn UV 365 nm 2: Curcumin tinh thu được qua sắc ký cột Khối lượng curcumin tinh thu được m1 = 0,6108 g
Hiệu suất tách cột: % 08 . 61 % 100 1 6108 . 0 % 100 0 1 = = = x x m m H Nhận xét: Hiệu suất tách cột tương đối cao: 61,08 %.
Kết quả kiểm tra định tính cur thu được bằng TLC hệ diclometan:etyl acetat (96:4) cho vết tròn, rõ cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm tách được là khá cao.
3.2. Tổng hợp dẫn xuất 3,5-Difluorophenylhydrazinocurcumin 3.2.1 Theo dõi phản ứng
Hình 3.4a: Phản ứng 3,5-DFPHC
Duy trì ổn định các điều kiện phản ứng và kiểm tra điểm dừng phản ứng bằng TLC. Quan sát quá trình phản ứng cho thấy, trong thời gian 14 giờ đầu phản
ứng xảy ra tương đối chậm, dựđoán có xuất hiện sản phẩm ngay trên đầu cur nhưng vết rất mờ. Phản ứng bắt đầu xảy ra nhanh dần từ giờ 16 đến giờ thứ 20, ở khoảng thời gian này cho thấy sản phẩm đậm lên rất rõ.
Tuy nhiên sau 21giờ theo quan sát TLC cho thấy sản phẩm không đậm thêm mà bắt đầu thấy sản phẩm phụ sinh ra trên đầu sản phẩm và phía dưới cur. Tại thời
điểm 21giờ nên dừng phản ứng và tiến hành SKC phân lập sản phẩm. Phương trình phản ứng:
Hình 3.4b Phản ứng tổng hợp 3,5-DFPHC
Theo dõi phản ứng bằng TLC hệ dung môi diclometan:etyl acetat (96:4)
Hình 3.5. Theo dõi bản mỏng bằng TLC
1: Thời gian phản ứng 16giờ 2: Thời gian phản ứng 21giờ 1
16giờ
2