và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm lấy mẫu, mổ khám và thử nghiệm hiệu lực của thuốc tẩy
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu phân dê tại 3 địa điểm là: huyện Gia Lâm - thành phố Hà Nội; huyện Ba Vì - tỉnh Hà Tây và huyện Lạc Thủy - tỉnh Hòa Bình. Tiến hành mổ khám dê tại 2 lò mổ dê ở quận Long Biên - thành phố Hà Nội và thị xf Sơn Tây - tỉnh Hà Tây. Thử nghiệm hiệu lực của thuốc tẩy và lá cây Keo giậu tại một số hộ chăn nuôi dê thuộc huyện Ba Vì - tỉnh Hà Tây.
3.1.2. Địa điểm xét nghiệm mẫu và thí nghiệm đặc điểm phát triển của trứng H. contortus
Các mẫu phân đ−ợc xét nghiệm tại phòng Bệnh lý - Ký sinh trùng - Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng.
Bố trí thí nghiệm đặc điểm phát triển của trứng H. contortus tại phòng Bệnh lý - Ký sinh trùng - Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng.
3.2. Nguyên vật liệu, nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Đối t−ợng nghiên cứu
Đối t−ợng đ−ợc chúng tôi lựa chọn là con dê; hệ ký sinh trùng đ−ờng tiêu hóa; thuốc tẩy ký sinh trùng và lá cây Keo giậu.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Đ−ợc tiến hành từ tháng 10 năm 2006 đến tháng 7 năm 2007.
3.2.3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá tình hình nhiễm chung ký sinh trùng đ−ờng tiêu hoá trên dê; loài nào nhiễm phổ biến, nhiễm nặng nhất (qua xét nghiệm phân và mổ khám).
- Xác định đặc điểm phát triển của trứng giun H. contortus, trong một số môi tr−ờng.
- Xác định khả năng tẩy trừ giun tròn của một số loại hoá d−ợc, lá cây Keo giậu t−ơi đ−ợc thu thập tại vùng chăn nuôi dê.
3.2.4. Nguyên liệu
- Tiến hành thu thập > 500 mẫu phân dê (không lặp lại) tại 3 địa điểm là huyện Ba Vì tỉnh Hà Tây, huyện Gia Lâm thành phố Hà Nội và huyện Lạc Thuỷ tỉnh Hoà Bình để điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đ−ờng tiêu hoá, đặc biệt l−u ý tới giun tròn dạ dày.
- Sử dụng một loại thảo mộc là lá cây Keo giậu có mọc nhiều trong tự nhiên ở trong khu vực có sự chăn thả đàn dê là phổ biến và dê cũng th−ờng xuyên ăn các loại lá này.
- Các loại hoá d−ợc sử dụng trong nghiên cứu là: Ivermectin, Levamisole, Fenbendazol ...
3.2.5. Ph−ơng pháp nghiên cứu
Chúng tôi thực hiện các ph−ơng pháp th−ờng qui trong phòng thí nghiệm ký sinh trùng. Ngoài ra, một số ph−ơng pháp nh− dò liều gây độc cấp của thuốc cũng đ−ợc tiến hành theo nh− h−ớng dẫn của các tài liệu tham khảo. Cụ thể các ph−ơng pháp đ−ợc áp dụng trong nghiên cứu này là:
Ph−ơng pháp kiểm tra trứng ký sinh trùng đ−ờng tiêu hoá th−ờng qui (Phù nổi, Lắng cặn): là ph−ơng pháp th−ờng qui, xác định sự có mặt mặt của trứng ký sinh trùng trong phân [22].
Mô tả một vài ph−ơng pháp sử dụng trong đề tài: 3.2.5.1. Ph−ơng pháp Phù nổi (Fiilleborn) [22]
Nguyên lý: Dựa vào sự chênh lệch về tỷ trọng giữa trứng giun và n−ớc muối bfo hòa. Trứng giun nhẹ hơn, sẽ nổi lên.
Đây là một kỹ thuật đơn giản trong phòng thí nghiệm, dễ thực hiện, chính xác. Bằng ph−ơng pháp này, có thể xác định sự có mặt của hầu hết trứng các loại trứng giun tròn, sán dây và cầu trùng. Để cho việc xét nghiệm chính xác, đòi hỏi mẫu phân phải đ−ợc lấy từ trực tràng của dê. Sau đó cho vào túi nilon, ghi nhfn và gửi ngay về phòng xét nghiệm.
Tiến hành: Cân hoặc −ớc l−ợng 3 - 5 g mẫu phân cần xét nghiệm, cho vào cốc thủy tinh sạch. Cho vào tiếp 5 - 10 ml n−ớc muối bfo hòa. Dùng đũa thủy tinh đánh tan mẫu phân với n−ớc muối bfo hòa thành một huyễn dịch. Lọc huyễn dịch qua phin lọc sang cốc lọ thủy tinh miệng nhỏ. Chờ 5 - 7 phút, dùng vòng vớt để vớt trứng. Cho lên phiến kính sạch và quan sát d−ới kính hiển vi độ phóng đại 90 - 100 lần.
3.2.5.2. Ph−ơng pháp Lắng cặn (Benedek) [22]
Nguyên lý: dựa trên sự chênh lệch về tỷ trọng giữa trứng và n−ớc th−ờng. Trứng sán lá và một vài loại trứng giun tròn khác, nặng hơn sẽ chìm xuống d−ới đáy cốc.
Với kỹ thuật này, có thể xác định sự có mặt của trứng các loại sán lá dạ cỏ, sán lá gan, sán lá ruột lợn và một số loại trứng giun nh− giun đầu gai… Để cho việc xét nghiệm chính xác, đòi hỏi mẫu phân phải đ−ợc lấy từ trực tràng của dê. Sau đó cho vào túi nilon, ghi nhfn và gửi ngay về phòng xét nghiệm.
Tiến hành: cân hoặc −ớc l−ợng 10 - 20 g mẫu phân cần xét nghiệm, cho vào cốc thủy tinh hình phễu. Đổ n−ớc th−ờng cho đến đầy cốc. Đánh tan mẫu phân với n−ớc thành dung dịch. Để cho dung dịch lắng thành trong, gạn bỏ phần n−ớc trong, giữ cặn. Tiếp tục bổ sung n−ớc sạch cho đầy cốc, để lắng và lại gạn phần n−ớc trong, giữ cặn. Làm nh− vậy 3 - 5 lần, đến khi phần cặn trong và dễ xem là đ−ợc. Đổ phần cặn vào đĩa lồng Petri, cho lên kính hiển vi soi ở độ phóng đại 40 - 90 lần.
3.2.5.3. Ph−ơng pháp Mc. Master [22],[48] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Là ph−ơng pháp dùng để định l−ợng số trứng có trong 1 gam phân. Dùng ph−ơng pháp này, đánh giá đ−ợc mức độ tác dụng hay ảnh h−ởng của các loại hoá d−ợc điều trị đối với loài ký sinh trùng đ−ờng tiêu hoá nào đó.
Thực hiện ph−ơng pháp này, cần có buống đếm Mc. master. (có nhiều loại buồng đếm Mc. Master; loại buồng 2 chamber hoặc 3 chamber hoặc 4 chamber). Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi sử dụng buồng đếm 2 chamber.
Tiến hành: cân chính xác 4 gam mẫu phân cần xét nghiệm, cho vào cốc thủy tinh 1. Bổ sung 56 ml n−ớc muối bfo hòa vào, đánh tan thành 1 huyễn dịch rồi lọc qua phin lọc sang cốc thứ 2. Dùng Pippet hút huyễn dịch từ cốc 2, rồi bơm vào đầy 2 buồng của buồng đếm Mc.Master. Khi thao tác, tránh những tác động tạo bọt khí trong buồng đếm. Để yên 5 - 7 phút, rồi đ−a buồng đếm lên kính hiển vi ở độ phóng đại 90 - 100 lần.
Đếm toàn bộ số trứng trong khung buồng đếm đf đ−ợc thiết kế sẵn. Gọi N1 là số trứng đếm đ−ợc trong buồng 1
Gọi N2 là số trứng đếm đ−ợc trong buồng 2
Gọi A là số trứng trong 1 gam phân tính đ−ợc. Công thức tính kết quả, số trứng/1 gam phân sẽ là:
A = (N1 + N2) x 50
3.2.5.4. Ph−ơng pháp mổ khám, mổ khám toàn diện của K.I.Skrjabin tìm ký sinh trùng [20], [22]
Tr−ớc khi mổ khám cần quan sát toàn bộ những thay đổi bên ngoài, da lông… Sau đó mổ từ ngoài vào trong, từ trên xuống d−ới.
Mổ khám phi toàn diện: khi nghiên cứu vấn đề gì, ở cơ quan bộ phận nào thì mổ kiểm tra tại cơ quan bộ phận đó.
Vừa mổ khám, vừa quan sát và thu thập mẫu, đánh ký hiệu sao cho không bị nhầm lẫn mẫu. Có thể dùng giấy can viết bằng bút chì sẽ không bị phai chữ và bay mất trong các dung dịch ngâm bảo quản mẫu vật.
3.2.5.5. Ph−ơng pháp mổ giun
Sau khi mổ khám dê thu thập mẫu, tiến hành phân loại hình thái và mổ giun thu trứng để tiến hành thí nghiệm. Vị trí mổ giun là 1/3 cơ thể tính từ mút đuôi trở lên. Dùng kéo vi phẫu cắt ngang thân giun, dùng panh kẹp phần buồng trứng và nhẹ nhàng kéo ra ngoài. Sau khi đf thu đ−ợc buồng trứng, tiến hành làm sạch bằng cách cho buồng trứng vào đĩa petri chứa n−ớc sinh lý trong 5 phút. Sau đó dùng kéo vi phẫu cắt nhỏ buồng trứng rồi nghiền nát trong dung dịch n−ớc sinh lý. Lọc qua phin lọc có kích th−ớc lỗ lọc là 25 mm. Thu phần n−ớc đf lọc qua phin lọc rồi cho vào ống ly tâm 10 ml, ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút/3 phút. Làm nh− vậy 3 lần để thu đ−ợc trứng H. contortus đảm bảo cho thí nghiệm. 3.2.5.6. Ph−ơng pháp dò liều gây độc của thuốc và cây thảo d−ợc [6], [8], [25], [55]
Mô tả ph−ơng pháp: Chuột nhắt trắng có trọng l−ợng 18 - 22 g, khỏe mạnh, không phân biệt giống, đ−ợc chia ngẫu nhiên thành các lô. Để chuột nhịn đói 16 giờ tr−ớc khi thí nghiệm. Dùng kim đầu tù cho chuột uống thuốc theo mức liều qui định cho từng lô, mỗi lần không quá 0,2 ml/10g thể trọng, với các mức liều tăng dần. Theo dõi tình trạng chung, hoạt động tự nhiên, hô hấp và tiêu hóa của chuột liên tục trong 7 ngày sau khi dùng thuốc. Đếm số chuột chết ở từng lô để xác định liều thấp nhất gây chết 100% và liều cao nhất gây chết 0%. Chuột chết đ−ợc mổ khám để đánh giá tổn th−ơng đại thể.
Tính LD50 theo ph−ơng pháp cải tiến của Litchfield - Wilcoxon [25] Các ph−ơng pháp cân, đo thân nhiệt, tần số hô hấp, nhu động dạ cỏ, đo tỷ khối huyết cầu,… là những thao tác đơn giản, không mô tả.
Xử lý số liệu trên các ch−ơng trình Excel và thống kê sinh vật học, toán thống kê [9], [24].
3.2.6. Bố trí thí nghiệm
3.2.6.1. Thí nghiệm 1: Điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đ−ờng tiêu hóa của dê qua xét nghiệm phân
Chọn 3 địa điểm nghiên cứu là Hà Nội, Hà Tây và Hòa Bình; ph−ơng pháp lẫy mẫu ngẫu nhiên không lặp lại các mẫu phân. Hà Nội lấy 186 mẫu phân; Hà Tây lấy 256 mẫu phân và Hòa Bình lấy 172 mẫu phân.
3.2.6.2. Thí nghiệm 2: Điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đ−ờng tiêu hóa của dê tại lò mổ
Chúng tôi tiến hành mổ khám dê tại 2 địa điểm là Hà Tây và Hà Nội. Trong đó, lò mổ tại Hà Nội, chọn dê có xuất xứ từ Hà Nội (29 con) và Hòa Bình (38 con); tại lò mổ Hà Tây, dê có xuất xứ từ Hà Tây (41 con).
Dê mổ khám ngẫu nhiên về lứa tuổi, tính biệt và giống … Mẫu đ−ợc ghi rõ nhfn và bảo quản để phân loại sau.
3.2.6.3. Thí nghiệm 3: Xác định một vài đặc điểm phát triển ở ngoài của trứng H. contortus
Bố trí 5 thí nghiệm
- Thí nghiệm xác định đặc điểm phát triển của trứng H. contortus ở trong môi tr−ờng tủ ấm: ở 18°C.
- Thí nghiệm xác định đặc điểm phát triển của trứng H. contortus ở trong môi tr−ờng tủ ấm: ở 25°C.
- Thí nghiệm xác định đặc điểm phát triển của trứng H. contortus ở trong môi tr−ờng tủ ấm: ở 30°C.
- Thí nghiệm xác định đặc điểm phát triển của trứng H. contortus ở môi tr−ờng ngoài: ở 20 - 25°C.
- Thí nghiệm xác định đặc điểm phát triển của trứng H. contortus ở môi tr−ờng ngoài: ở 26 - 32°C.
Kiểm tra sự phát triển của trứng hàng ngày tại các lô thí nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.6.4. Thí nghiệm 4: Xác định hiệu lực của thuốc tẩy và lá Keo giậu đối với giun tròn đ−ờng tiêu hóa của dê
Sử dụng 3 loại thuốc tẩy là Ivermectin, Levamisole, Fenbendazol và lá cây Keo giậu để tẩy cho dê; mỗi loại thuốc đ−ợc tẩy cho 15 dê.
Tr−ớc khi tẩy, kiểm tra toàn đàn dê và chọn mẫu dê có c−ờng độ nhiễm giun tròn đ−ợc đánh giá là nặng để tẩy.
Tr−ớc và sau khi tẩy 2 giờ kiểm tra một số chỉ tiêu sinh lý nh− thân nhiệt, hô hấp, nhu động dạ cỏ.
Sau khi tẩy 7, 14, 21 và 28 ngày, tiến hành lấy mẫu phân để kiểm tra sự tái nhiễm giun tròn hay hiệu lực của thuốc theo thời gian.
Tr−ớc và sau 28 ngày tẩy, tiến hành cân trọng l−ợng và lấy máu kiểm tra tỷ khối huyết cầu; mổ khám ngẫu nhiên, mỗi lô 03 dê để kiểm tra hiệu lực.