L *i cam oan
1.8.Quá trình ông l/nh dung d0ch
7 NG HE
1.8.Quá trình ông l/nh dung d0ch
Hình 1.9. ông l,nh n 6c mu)i sinh lý (Masuda, 1992)
Khi ông l/nh tinh d0ch s t/o tinh th5 và giãn n= tinh th5 b ng ch( x y ra trong i3u ki n ông l/nh ch m, còn khi ông l/nh c c nhanh thì hai hi n t!"ng
trên không x y ra, mà x y ra hi n t!"ng th y tinh hóa (Vitrification), t/o ra các
h/t b ng nh1 li ti, lo/i trB !"c hi n t!"ng giãn n= tinh th5 (Mazur, 1980).
1.4.2. nh h ng c a hi n t ng ông b ng lên t bào tinh trùng
1.4.2.1. Hi n t ng ông b ng n i bào
Tinh trùng b0 ch t ho-c m#t n ng l c ho/t .ng, khi c#u t/o n.i bào b0 phá v% do vi c hình thành tinh th5 n!+c n.i bào. N u tinh trùng nMm trong dung d0ch mu i sinh lý có th5 lo/i trB !"c hi n t!"ng này vì !"c các phân tD n!+c d/ng l1ng bao quanh, m-c dù dung d0ch ngo/i bào b2t ,u ông b ng = nhi t . -20C
ho-c -50C. Nh! v y quá trình ông b ng sN không làm h/i t+i t bào tinh trùng
cho n khi n!+c n.i bào ông l/nh m-c dù dung d0ch môi tr!*ng bao quanh ã
ông l/nh (Mazur, 1980).
1.4.2.2. S m t n c c a t bào tinh trùng
- N u n!+c n.i bào thoát ra ngoài, tinh trùng sN b0 teo l/i, nh!ng v'n có tinh trùng s ng !"c = nhi t . th#p ho-c siêu th#p chAng h/n âm 1960C. Trong quá trình làm l/nh, n!+c ngo/i bào ông b ng làm áp su#t thGm th#u chênh l ch, n!+c n.i bào thoát ra kh1i tinh trùng và ti p t6c ông b ng ph,n ngo/i bào. Có 80% n!+c n.i bào b0 ông l/nh = âm 150C và !"c thoát ra ngoài do ó ng n ngBa !"c hi n t!"ng ông b ng n.i bào (Hà V n Chiêu, 1999).
- Ph,n l+n n!+c n.i bào thoát ra kh1i tinh trùng = âm 300C. Tinh trùng có th5 ch0u l/nh = âm 300C, có th5 t)n t/i !"c = âm 1960C, còn t bào bình th!*ng
thì b0 phá h y, tuy nhiên c4ng có tinh trùng không có kh n ng ch0u l/nh do các
bi n >i lý - hoá - sinh x y ra. NhFng bi n >i lý - hóa - sinh có th5 x y ra trong t bào b0 phá h y = nhi t . th#p, thay >i trong c#u trúc n.i bào là do thay >i liên k t hydro = chuIi polyme. S ông -c hóa không th5 quay tr= l/i nh! c4 và s k t t a protein do m#t n!+c c a nguyên sinh ch#t (Iritani, 1980).
1.4.2.3. Hi n t ng ông b ng ngo i bào
Trong khi ông l/nh ngo/i bào, sN x y ra hi n t!"ng n)ng . ch#t hòa tan
kèm theo áp su#t thGm th#u t ng lên và kéo theo nhFng thay >i v3 . pH. Các
ch#t i n gi i nh! Natri và Kali có nhi3u nh#t trong tinh thanh và chúng t)n t/i = d/ng Natri clorua, Kali clorua. L i5m eutectic, n)ng . các mu i này cao nh#t,
là khi nhi t . âm 21,20C i v+i Natri clorua và âm 11,10C i v+i Kali clorua
và biên . nhi t . này có h/i cho tinh trùng. Do có s t ng n)ng . ch#t hòa tan i kèm v+i t ng áp su#t thGm th#u c4ng nh! pH thay >i t#t c x y ra trong biên
. nhi t . này, mà ng!*i ta không rõ cái gì có tác h/i nh#t n tinh trùng (Hà
V n Chiêu, 1999).
1.4.2.4. Chuy n ng c a n c và s dãn n c a tinh th n c
- Hi n t!"ng gi i ông gi ng nh! ông l/nh có nh h!=ng n tinh trùng
trùng và s dãn n= c a các tinh th5 n!+c á trong quá trình ông l/nh ho-c tan b ng có th5 gây t>n th!&ng tinh trùng. B t khí t)n t/i trong tinh th5 b ng c4ng có th5 gây t>n h/i tinh trùng trong quá trình này (Hà V n Chiêu, 1999).
- Các t>n th!&ng trên có th5 lo/i trB !"c bMng cách gi m kích c% các tinh th5 b ng và làm t ng s l!"ng tinh th5 nh1 h&n. T c . làm l/nh nhanh có th5 làm t ng tinh th5 nh1. Nói cách khác là khi làm l/nh nhanh sN ng n ch-n !"c s l+n lên c a các tinh th5 b ng trong dung d0ch và t/o i3u ki n ông l/nh gi ng
nh! th y tinh hóa. Tuy v y, b ng th y tinh g)m các tinh th5 b ng sN không >n
0nh = nhi t . trên âm 1290C và s chuy5n .ng và tái tinh th5 hóa c a chúng sN gây t>n h/i t bào tinh trùng. Chuy5n .ng sN t ng lên = trên âm 400C và d gây t>n h/i tinh trùng -c bi t là = kho ng âm 200C (Masuda, 1992).
- NhFng nh h!=ng trên có th5 gây bi n >i hình thái tinh trùng, -c bi t là s d0 hình acrosome; gây rò r( lipide ra kh1i th5 (nh, = tinh trùng bò c th#y rõ hi n t!"ng rò r( choline plasmalogen, lecithin và sphingomielin, gây ra phá
h y màng sinh ch#t và gi m ngu)n n ng l!"ng cho t bào tinh trùng; gây hi n (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
t!"ng th#m qua c a các h"p ch#t vô c&, v+i tinh trùng bò c, ion K+ và Mg+ ra kh1i t bào còn ion Na+ và Ca+ thì = l/i; các h"p ch#t cao phân tD thoát kh1i tinh
trùng nh! các enzyme g)m: Hyaluronidase, lactic dehyrogenase, glutamic-
oxaloacetic transaminase và alkaline phosphatase.
- Nói chung, hi n t!"ng ông b ng làm gi m s c s ng, s c v n .ng và trao
>i ch#t, có kho ng tB 10% n 50% s tinh trùng trong tinh d0ch b0 ch t, m-c dù ã !"c pha vào môi tr!*ng có ch a glyceryl. Tuy nhiên, các tinh trùng s ng có c các tinh trùng v n .ng và trao >i ch#t kém. S gi m trao >i ch#t c a tinh trùng th#y rõ = quá trình glycolysis h&n là quá trình hô h#p (Masuda, 1992).
1.4.3. M t s y u t làm t ng s c kháng ông c a tinh trùng
Khi ông l/nh ho-c gi i ông, các hi n t!"ng nêu trên sN e do/ s s ng
c a tinh trùng, nh!ng khi có bi n pháp ch ng ông thì kh n ng t)n t/i c a tinh
trùng là th c t . Các y u t sau ây giúp tinh trùng t)n t/i khi ông l/nh ho-c
1.4.3.1. Thành ph n c a môi tr ng pha loãng
- Thành ph,n c& b n c a môi tr!*ng pha loãng tinh d0ch là !*ng
saccharid, ch#t m và lòng 1 tr ng gà. S c s ng c a tinh trùng khi ông l/nh
và gi i ông khác nhau tùy theo các thành ph,n này.
- N)ng . t i !u c a lòng 1 tr ng tB 15% n 20%, n u n)ng . này quá
th#p ho-c quá cao thì không t t cho tinh trùng, m-c dù lòng 1 tr ng ã b o v
tinh trùng không b0 t>n h/i trong khi ông l/nh. Ch c n ng này ch y u do tác
.ng c a lipoprotein và lecithin trong lòng 1. !*ng saccharide óng vai trò
quan tr ng trong môi tr!*ng, do tác .ng n áp su#t thGm th#u, nó có tác d6ng
b o v tinh trùng khi = nhi t . th#p và là ngu)n n ng l!"ng cho tinh trùng.
- NhFng saccharide có kh i l!"ng phân tD cao, làm cho ho/t l c c a tinh trùng t t h&n sau khi ông l/nh và gi i ông. Các saccharide có phân tD l!"ng cao (tính theo phân tD l!"ng gi m d,n) bao g)m. Trisaccharide, disaccharide, hexoses
và pentone. Trong s hexose thì glucose có hi u qu nh#t, còn các ch#t a !*ng
polysaccharide thì ít có tác d6ng. B o v l/nh bMng saccharide là nh* có nhi3u nhóm
hydroxy (-OH) trong c#u trúc, do ó có xu h!+ng hình thành liên k t hydro.
- Ch#t m có vai trò quan tr ng trong duy trì màng sinh ch#t c a tinh trùng
khi ông l/nh và khi gi i ông, trong kích thích trao >i ch#t di n ra bình th!*ng =
tinh trùng sau gi i ông )ng th*i duy trì s c s ng c a chúng. Ch#t m ph i phù
h"p nh! là môi tr!*ng khi ông l/nh và ph i có -c tính sau:
+ Duy trì m c th#p nh#t v3 s t>n h/i cho tinh trùng do các mu i gây ra. + Ph i tan trong n!+c v+i hMng s phân ly i n tích là 6-8.
+ Kh n ng th#m qua màng sinh ch#t ph i th#p và có s c 3 kháng m/nh v+i các enzyme. m ion zwitter có nhFng tính ch#t trên nên nó t t h&n so v+i m
phosphat ho-c m Natri citrat. m ion zwitter là Trihydroxy methylaminomethane (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Tris) và N-hydroxymethyl-2- aminoethanesulfonic acid (TES). + B o qu n = 50C tr!+c khi ông l/nh
- B o qu n = 50C tr!+c khi ông l/nh sN t ng c!*ng s c kháng ông cho
tinh trùng bò. Thông th!*ng tinh bò sau khi khai thác và tiêu chuGn pha ch
+ Pha loãng l,n ,u tinh d0ch = 350C.
+ Làm l/nh d,n xu ng 50C và b o qu n tB 1,5 n 2 gi* (cách 1). + Pha loãng l,n hai v+i môi tr!*ng có ch a glycerol.
+ Cân bMng trong 2 n 3 gi*.
+ ông l/nh tinh trùng.
+ B o qu n tinh trùng ã làm l/nh = 50C tr!+c khi pha loãng l,n hai ã
nâng cao áng k5 t@ l s ng c a tinh trùng sau khi ông l/nh và gi i ông.
- M.t cách khác (cách 2) c a ph!&ng pháp này là b o qu n qua êm (tB
20 n 22 gi*), tinh trùng ã làm l/nh = 50C, tr!+c khi pha loãng l,n hai. S c
s ng c a tinh trùng theo cách xD lý hai t t h&n so v+i cách sD lý thông th!*ng
(cách 1). Cách 3 là b o qu n tinh trùng qua êm khi ã cân bMng v+i glycerol
trong 20 n 22 gi*, = 50C sau khi pha loãng l,n hai. Cách hai t t h&n nhi3u so
v+i cách 3 và i3u này th5 hi n s c kháng ông c a tinh trùng có khác nhau tùy
theo giai o/n nh/y c m v+i nhi t . th#p (Takahashi, 1992).
1.4.3.2. N ng c a glycerol và th i gian cân b ng
Hình 1.10. nh h ;ng c a glycerol trong dung d0ch NaCl so v6i n8ng .:
NaCl trong dung d0ch còn l,i khi dung d0ch NaCl (0,154M) . *c .ông l,nh (Masuda, 1992)
- N)ng . glycerol trong môi tr!*ng pha loãng cu i cùng 5 làm ông l/nh tinh trùng bò vào kho ng 7%, nh!ng t@ l này có h&i khác nhau tùy theo các thành ph,n c a môi tr!*ng pha loãng. N)ng . t i !u cho s c s ng c a tinh trùng là 11% v+i sFa khD b&. N)ng . glycerol trong môi tr!*ng pha loãng có m i t!&ng quan áng tin c y v+i t c . gi i ông, ó là n)ng . glycerol cao trong môi
tr!*ng pha loãng là c,n thi t cho t c . gi i ông nhanh (Masuda, 1992).
- Th*i gian tB lúc b> sung glyceryl vào môi tr!*ng pha loãng (pha loãng
l,n hai) n khi b2t ,u làm ông l/nh !"c g i là th*i gian cân bMng glycerol.
1.4.3.3. T c làm l nh
- T c . làm l/nh quá nhanh sN gây t>n h/i t+i tinh trùng vì nó gây ra siêu l/nh, th5 vGn và n!+c l!u giF trong t bào. i3u ó gây ra ông l/nh ngo/i bào
và sau ó ông l/nh n.i bào. T c . làm l/nh ch m sN gây ra t p trung n)ng .
cho c dung d0ch ngo/i bào và dung d0ch n.i bào và sN làm r i lo/n t bào, ây !"c coi là nh h!=ng c a dung d0ch. T c . làm l/nh t i !u là t c . làm gi m t i a c ông l/nh n.i bào và nh h!=ng c a dung d0ch.
- T c . làm l/nh t i !u này khác nhau không ch( theo lo/i t bào mà còn
theo các y u t nh! các thành ph,n c a th5 vGn t bào và lo/i ch#t ch ng ông
b ng. ChAng h/n dung d0ch !*ng saccharide !"c ông l/nh nhanh ( ông l/nh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tB 2 n 4 phút, 50C xu ng âm 790C), cho ho/t l c tinh trùng sau gi i ông cao
h&n so v+i ông l/nh ch m ( ông l/nh 45 phút, tB 50C xu ng âm 790C), vì ã ng n c n !"c nh h!=ng c a dung d0ch. Môi tr!*ng pha loãng có n)ng . glycerol tB 5 n 7% !"c ông l/nh nhanh ( ông l/nh tB 3 n 5 phút, tB 50C xu ng -1300C) cho ho/t l c tinh trùng cao h&n so v+i ông l/nh ch m ( ông l/nh
tB 20 n 40 phút, tB 50C xu ng âm 790C)(Masuda, 1992).
1.4.3.4. T c gi i ông
- T c . gi i ông tinh ông l/nh có nh h!=ng l+n n s c s ng, ho/t l c,
Hình 1.11. Bi n .>i v1t lý trong t bào khi .ông l,nh (Mazur, 1980)
- Gi i ông tinh c ng r/ bMng n!+c 350C s c s ng tinh trùng cao h&n so v+i n!+c 40C ho-c 200C. Gi i ông = n!+c tB 350C n 750C c4ng cho t@ l acrosome bình th!*ng cao h&n so v+i n!+c 40C ho-c 200C. Nh!ng n u gi i ông bMng n!+c có nhi t . cao h&n nFa, chAng h/n n!+c 900C, sN làm gi m s c s ng
c a tinh trùng. N u tinh trùng !"c b o qu n = nhi t . 370C sau khi gi i ông,
c ng r/ nào !"c gi i ông nhanh = nhi t . cao h&n sN có s c s ng tinh trùng cao h&n.
1.4.3.5. Th i gian b o qu n
- Tinh trùng ông l/nh ph i luôn luôn !"c b o qu n ng p chìm trong nit& l1ng (âm 1960C), n u b o qu n t t sau vài ch6c n m, t@ l s ng và s c ho/t .ng c a tinh trùng v'n không thay >i, kh n ng th6 tinh v'n không b0 gi m (Hà V n
Chiêu, 1996). L Th6y S?, tinh bò ông l/nh b o qu n 20 n m v'n th6 tinh và bò
mJ C bê con ngày 25/7/1975.
- L Nh t B n, tinh c ng r/ b o qu n tB 4 n m n 13 n m v'n có ho/t l c
tinh trùng sau gi i ông tB 45% n 55% và có t@ l th6 tinh 54%. Có nhi3u tr!*ng h"p tinh ông l/nh b o qu n 20 n m v'n có t@ l th6 tinh cao, lên n 69,8% (Masuda, 1992).
1.5. Tình hình nghiên c+u trong và ngoài n 6c
1.5.1. L ng xu t tinh
- L!"ng xu#t tinh (kh i l!"ng tinh d0ch, th5 tích tinh d0ch:V) là s ml tinh d0ch l#y !"c trong m.t l,n xu#t tinh thành công (ml/l,n khai thác). L!"ng xu#t tinh liên quan ch-t chN t+i gi ng, tu>i, ch . ch m sóc, nuôi d!%ng, kích th!+c d0ch hoàn, mùa v6, m c . kích thích tính d6c tr!+c khi l#y tinh, ph n x/ nhGy giá và k? thu t khai thác tinh.
- Garner et al. (1996) cho bi t, bò c gi ng Holstein Friesian trC có l!"ng xu#t tinh ít h&n bò tr!=ng thành. L bò c gi ng, l!"ng xu#t tinh bình quân th!*ng tB 5 n 6 ml, dao .ng tB 2ml n 12ml. N u l#y tinh hai l,n thì l!"ng xu#t tinh thu !"c l,n l#y th hai th!*ng cao h&n l,n l#y ,u.
- Trong th c t s n xu#t, không ph i tinh d0ch c a l,n l#y tinh nào c4ng
/t tiêu chuGn pha ch và s n xu#t tinh ông l/nh (Hoàng Kim Giao và Nguy n
Thanh D!&ng, 1997), ch( nhFng l,n l#y tinh qua ki5m tra ánh giá có các ch( tiêu /t tiêu chuGn quy 0nh c a tBng n!+c, = Vi t Nam theo tiêu chuGn Vi t Nam
TCVN 8925 : 2012 quy 0nh ho/t l c tinh trùng ≥70%, n)ng . tinh trùng ≥800