3. NỘI DUNG, đỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU28 VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp kiểm tra các ựặc tắnh sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập ựược
- Thử phản ứng Oxydase: - Thử phản ứng Catalase: - Thử phản ứng sinh Indol: - Thử phản ứng lên men ựường:
3.4.2. Phương pháp xác ựịnh serotyp của các chủng vi khuẩn phân lập ựược
3.4.2.1. Phương pháp xác ựịnh serotyp của vi khuẩn A.pleuropneumoniae bằng phương pháp ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn
- Chuẩn bị kháng huyết thanh: kháng huyết thanh chuẩn
A.pleuropneumoniae ựược pha loãng theo cơ số 2 thành: 1/2, 1/4, 1/8. Sau ựó ủ với protein A chiết xuất từ Staphylococcus aureus theo tỷ lệ 1:5 trong thời gian 2 giờ ở 370C.
- Chuẩn bị kháng nguyên: cấy vi khuẩn trên môi trường TSA trong thời gian 18 giờ, sau ựó thu hoạch với nước sinh lý.
- Tiến hành: lấy 10 ộl kháng huyết thanh chuẩn hòa lẫn với 10 ộl kháng nguyên, trộn ựều trong vòng khoảng 5 giây.
- Kết quả: xuất hiện phản ứng ngưng kết lên bông thì phản ứng dương tắnh, không xuất hiện ngưng kết thì phản ứng âm tắnh.
3.4.2.2. Phương pháp xác ựịnh serotyp của vi khuẩn P.multocida bằng phản ứng PCR
Các typ giáp mô A, B, D của vi khuẩn P.multocida ựược xác ựịnh dựa trên phản ứng PCR phức hợp (Multiplex PCR), gồm các cặp mồi: CAPA-F và CAPA-R ựể xác ựịnh serotyp A, CAPB-F và CAPB-R ựể xác ựịnh serotyp B, CAPD-F và CAPD-R ựể xác ựịnh serotyp D. Trình tự các cặp mồi và kắch cỡ sản phẩm ựược trình bày ở bảng 3.1.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
- ADN mẫu của chủng vi khuẩn cần xác ựịnh ựược lấy trực tiếp từ khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn ựã ựược nuôi cấy 370C/24h trên môi trường thạch máu.
- Phản ứng PCR ựược thực hiện với tổng thể tắch là 25 ộl, bao gồm các thành phần: 1 ộl của mỗi loại mồi (3.2 ộM/ộl), 5 ộl PCR buffer 5x [(750 mM Tris-HCl (pH 8.8), 200 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20) (ABgene), 2 mM MgCl2, 200 ộM của mỗi loại dNTP], 0.05 ộl Taq DNA Polymerase (5 units/ộl) (ABgene), nước cất vừa ựủ 25 ộl.
- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR gồm các giai ựoạn: tiền biến tắnh ở 940C/3 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tắnh ở 940C/1 phút, ủ bắt cặp mồi ở 550C/1 phút, tổng hợp ở 720C/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 720C/7 phút.
- Sản phẩm của phản ứng PCR ựược ựiện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch 1xTAE với hiệu ựiện thế 100V/30 phút, sau ựó nhuộm với ethidium bromide trong 15 - 20 phút. đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000. Các vạch ADN ựược ựánh giá bằng cách so sánh với ADN ladder chuẩn và mẫu ựối chứng dương.
Bảng 3.1 Trình tự các cặp mồi dùng ựể xác ựịnh serotyp A, D của vi khuẩn P.multocida
Serotyp Ký hiệu
mồi Trình tự mồi
Sản phẩm
(bp)
CAPA-F 5 -TGC CAA AAT CGC AGT GAG-3Ỗ
A CAPA-R 5Ỗ-TTC CCA TCA TTG TCA GTG-3Ỗ 1044
CAPD-F 5Ỗ-TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC-3Ỗ D
CAPD-R 5Ỗ-CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG-3Ỗ 657
3.3.2.3 Phương pháp xác ựịnh serotyp của vi khuẩn S.suis bằng phản ứng PCR
Các serotyp 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S.suis thường gặp gây bệnh nhất ở lợn ựược xác ựịnh bằng phản ứng Multiplex PCR. Các cặp mồi dùng ựể xác
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
ựịnh các serotyp 1, 2, 7 và 9 của S.suis ựược lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps 1J-F và cps 1J-R ựể xác ựịnh serotyp 1, cps 2J-F và cps 2J-R ựể xác ựịnh serotyp 2, cps 7H-F và cps 7H-R ựể xác ựịnh serotyp 7, cps 9H-F và cps 9H-R ựể xác ựịnh serotyp 9. Trình tự các cặp mồi và các sản phẩm tương ứng của chúng ựược trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 Trình tự các cặp mồi dùng ựể xác ựịnh các serotyp 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn Streptococcus suis
Serotyp Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp) 1 cps1J-F cps1J-R 5'-TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T -3' (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5'-TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A-3' 637
2 cps2J-F
cps2J-R
5'-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3'
5'-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC -3' 498
7 cps7H-F
cps7H-R
5'-AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG-3'
5'-TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA-3' 379
9 cps9H-F
cps9H-R
5'-GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT-3'
5'-CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA-3' 303
Thành phần của phản ứng Multiplex PCR dùng ựể xác ựịnh serotyp của vi khuẩn S.suis tương tự như trong phản ứng dùng ựể xác ựịnh serotyp của vi khuẩn P.multocida. Chu kỳ nhiệt của phản ứng gồm: tiền biến tắnh ở 940C/5 phút và 35 chu kỳ nhiệt (biến tắnh ở 940C/1 phút, ủ bắt cặp mồi ở 530C/1 phút, tổng hợp ở 720C/90 giây) và kéo dài cuối cùng ở 720C/7 phút.
3.3.3. Phương pháp xác ựịnh ựộc lực của các chủng vi khuẩn phân lập ựược
Xác ựịnh ựộc lực của các chủng vi khuẩn A.pleuropneumoniae, P.multocida và S.suis phân lập ựược trên chuột bạch theo phương pháp của Sawada (1985).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
khuẩn cần kiểm tra tiêm vào phúc xoang cho 2 chuột bạch, liều tiêm 0,2 ml/chuột. Theo dõi chuột trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, thời gian giết chết chuột ựể ựánh giá ựộc lực của vi khuẩn. Những chuột chết ựược mổ khám quan sát bệnh tắch, lấy máu tim ựể phân lập lại vi khuẩn.
Công thức tắnh liều LD50: Lg LD50 = Lg A + a Ờ 50 x d a - b
Với: A là nồng ựộ pha loãng gây chết sát trên 50% a là tỷ lệ chết do liều A gây ra (%)
b là tỷ lệ chết do liều B gây ra (%), trong ựó B là nồng ựộ pha loãng gây chết sát dưới 50%.
3.3.4. Phương pháp chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn
Chúng tôi ựã tiến hành chế vacxin thử nghiệm bằng phương pháp chế vacxin vô hoạt toàn khuẩn có bổ trợ keo phèn theo phương pháp của Viện Thú y và ựược mô tả như sau:
Phương pháp chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn
Công nghệ chế vacxin vô hoạt ựược sử dụng ựể chế vacxin thử nghiệm là công nghệ nuôi cấy tĩnh có bổ trợ keo phèn
* Chọn chủng vi khuẩn: 03 loại vi khuẩn ựược lựa chọn ựể chế tạo vacxin gồm có: - Actinobacillus pleuropneumoniae 03 chủng
- Pasteurella multocida 02 chủng - Streptococcus suis 01 chủng
* Chế vacxin thử nghiệm phòng bệnh: ựã thực hiện tại Bộ môn Vi trùng Ờ Viện Thú y theo quy trình chung sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có bổ trợ keo phèn theo hình 3.1.
* Kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của canh trùng Actinobacillus pleuropneumoniae,Pasteurella multocida và Streptococcus suis dùng sản xuất vacxin thử nghiệm:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giống vi khuẩn gốc
Thạch PPLO (Môi trường có bổ sung NAD), Thạch máu Tủ ấm CO2/37oC/24 giờ
Chọn khuẩn lạc ựiển hình
Thuần khiết 10ml nước thịt TYE, BHI, THB (giống sản xuất nhỏ)
Tủ ấm 37oC/24 giờ Lắc 300 Ờ 500 lần/phút
Thuần khiết 100ml nước thịt TYE, BHI, THB (giống sản xuất nhỡ)
Tủ ấm 37oC/24 giờ Lắc 300 Ờ 500 lần/phút
1000ml TYE. BHI (Giống sản xuất lớn) (370C/24h; Lắc 300 Ờ 500 lần/phút)
đếm số lượng vi khuẩn đạt tiêu chuẩn thuần khiết
Trộn lẫn 3 loại canh trùng Vô hoạt bằng formalin (với tỷ lệ 0,5%)
Tủ ấm 37oC/24 giờ Lắc 300 Ờ 500 lần/phút đạt chỉ tiêu vô trùng
Bổ sung keo phèn với tỷ lệ 1/5 (20%) đạt chỉ tiêu vô trùng
Ra chai Kiểm tra
An toàn Vô trùng Hiệu lực
Hình 3.1: Sơ ựồ tóm tắt quy trình chế tạo vacxin viêm phổi lợn
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Tiến hành lấy mẫu ựể kiểm tra thuần khiết bằng cách: phết tiêu bản, nhuộm Gram, ựồng thời nuôi cấy trên các loại môi trường: nước thịt thường, nước thịt TYE, THB (Todd Herwitt Broth) thạch máu cấy kèm
Staphilococcus aureus, thạch TSA có bổ sung YE tươi.
* Phương pháp xác ựịnh số lượng vi khuẩn
Mẫu canh khuẩn cần xác ựịnh ựược lấy vô trùng, sau ựó pha loãng canh khuẩn với nước muối sinh lý vô trùng thành các ựộ pha loãng khác nhau từ 10-1 ựến 10-8. Dùng 3 ựộ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8, mỗi ựộ pha loãng cấy trên 3 ựĩa thạch TSA (1-3% YE), mỗi ựĩa nhỏ 0,1ml, dàn ựều trên mặt thạch. Sau 18 giờ nuôi cấy ở tủ ấm 37oC có 5% CO2, tiến hành ựếm số lượng khuẩn lạc mọc ở các ựĩa thạch.
Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn ựược tắnh theo công thức dưới ựây với ựơn vị tắnh là CFU:
X = a x N x 10 Trong ựó:
X: số lượng tế bào vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn. N: hệ số pha loãng.
a: số vi khuẩn có trong 0,1ml canh khuẩn pha loãng.
* Kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn trên chuột nhắt trắng theo phương pháp thường quy của Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y.
Vacxin viêm phổi lợn sau khi chế tạo phải ựược kiểm nghiệm, kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn.
* Kiểm tra vô trùng:
Từ mỗi lô vacxin, lấy ra 5 chai theo phương pháp ngẫu nhiên, lắc ựều, cấy 0,2ml vacxin vào các ống môi trường thạch thường, thạch máu, thạch TSA (có bổ trợ YE), thạch MacConkey, nước thịt thường, nước thịt TYE, THB nước thịt gan yếm khắ, thạch nấm. Mỗi loại môi trường cấy kiểm tra 4 ống.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Nếu sau 7 ngày không có bất cứ một loại vi khuẩn nào mọc trên các môi trường thì vacxin ựược coi là ựạt tiêu chuẩn vô trùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng:
đối với mỗi lô vacxin: dùng 20 chuột nhắt trắng khỏe mạnh chia làm 2 lô. Lô thắ nghiệm, tiêm vacxin với các ựường tiêm: xoang phúc mạc 10 chuột với hai liều tiêm khác nhau, ựường tĩnh mạch ựuôi 5 chuột (tiêm phần nước trong của lọ vacxin). Lô ựối chứng 5 chuột không tiêm vacxin. Theo dõi chuột trong 10 ngày. Vacxin ựạt chỉ tiêu an toàn khi chuột ở các lô thắ nghiệm và ựối chứng ựều sống khỏe mạnh qua thời gian theo dõi.
* Kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp thay thế trên chuột nhắt trắng:
đối với mỗi lô vacxin, miễn dịch cho 35 chuột khỏe mạnh bằng ựường tiêm dưới da, 2 mũi tiêm, mũi 2 cách mũi 1 là 7 ngày với liều 0,2ml vacxin/con và 5 chuột ựối chứng tiêm 0,2ml nước thịt TYE vào dưới da. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách cường ựộc với canh khuẩn của từng chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin (03 chủng A.pleuropneumoniae; 02 chủng
P.multocida và 01 chủng S.suis) mỗi chủng vi khuẩn công cường ựộc cho 5 chuột ựã tiêm vacxin chứa 10 LD50 (LD50: liều gây chết 50% chuột nhắt trắng) có trong 0,2ml. Theo dõi trong 10 ngày, lô vacxin ựược ựánh giá ựạt hiệu lực trong phương pháp kiểm tra thay thế) nếu chuột ựối chứng chết hết, trong khi lô thắ nghiệm số chuột ựược công cường ựộc phải còn sống 3/5 là ựạt yêu cầu 5 chuột tiêm vacxin không công cường ựộc phải ựảm bảo 5/5 khỏe mạnh. * Kiểm tra ựáp ứng miễn dịch ở lợn sau tiêm vacxin
20 lợn khỏe mạnh 5 tuần tuổi, ựược chia thành 2 lô (1 lô thắ nghiệm 15 lợn và 1 lô ựối chứng, 5 lợn).
Lô thắ nghiệm 1: ựược tiêm vacxin viêm phổi với liều 2 ml/con sau hốc tai, dưới da (lợn 6 tuần tuổi) và ựược tiêm nhắc lại mũi 2 sau 7 ngày.
Lợn ở lô ựối chứng: ựược tiêm nước muối sinh lý 0,9% với liều 2 ml/con. Tiến hành theo dõi trạng thái và biểu hiện lâm sàng của các lợn trước và
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
sau khi tiêm vacxin. Tiến hành lấy máu vào các thời ựiểm: trước khi tiêm vacxin và sau khi tiêm vacxin mũi 2 vào ngày thứ 21, 2 tháng, 3 tháng và 4 tháng. Thắ nghiệm ựược bố trắ, thực hiện tại Công ty cổ phần giống gia súc Thái Bình. Xác ựịnh mức ựộ ựáp ứng miễn dịch của lợn thắ nghiệm bằng phản ứng ngưng kết.
* Kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp công cường ựộc cho lợn:
35 lợn khỏe mạnh 5 tuần tuổi, ựược chia thành 2 lô (1 lô thắ nghiệm 30 lợn và 1 lô ựối chứng, 5 lợn).
Lô thắ nghiệm 1: ựược tiêm vacxin viêm phổi với liều 2 ml/con sau hốc tai, dưới da (lợn 6 tuần tuổi) và ựược tiêm nhắc lại mũi 2 sau 7 ngày.
Lợn ở lô ựối chứng: ựược tiêm nước muối sinh lý 0,9% với liều 2 ml/con. Tiến hành theo dõi trạng thái và biểu hiện lâm sàng của các lợn trước và sau khi tiêm vacxin. Sau 21 ngày tiêm mũi 1 cho lợn, tiến hành thử thách cường ựộc với canh khuẩn của từng chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin (03 chủng A.pleuropneumoniae; 02 chủng P.multocida và 01 chủng S.suis) mỗi chủng vi khuẩn công cường ựộc cho 5 lợn ựã tiêm vacxin chứa 100 liều LD50
(LD50: liều gây chết 50% chuột nhắt trắng) có trong 5ml canh trùng cường ựộc. Theo dõi trong 10 ngày, lô vacxin ựược ựánh giá ựạt hiệu lực trong phương pháp công cường ựộc trên lợn nếu lợn trong ựối chứng chết hết, trong khi lô thắ nghiệm số lợn ựược công cường ựộc phải còn sống 3/5 là ựạt yêu cầu. Với 5 lợn ựối chứng phải chết 5/5.
3.3.5. Phương pháp phân tắch thống kê
- Tắnh liều LD50 theo Reed & Muench (1938).
- Số liệu thu ựược trong các thắ nghiệm ựược xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học với sự hỗ trợ của phần mềm Excel.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 38