- Bệnh tích vi thể:
3. Đối t−ợng, địa điểm, nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.5.3. Ph−ơng pháp đánh giá hiệu lực của vacxin bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc
3.4.2. Gà thí nghiệm
Để làm thí nghiệm, chúng tôi sử dụng gà giống ISSA
3.4.3 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất
Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất của phòng thí nghiệm thuộc trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung Ương I
3.5 Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.5.1 Ph−ơng pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin HipraGumboro-GM97 trên thực địa GM97 trên thực địa
Thực hiện trên đàn gà con ISSA 10 ngày tuổi, chia làm hai lô Lô thí nghiệm
Lô 1: Dùng vacxin HipraGumboro-GM97 cho gà uống với liều: 10 liều vacxin/ gà
Lô 2: Dùng vacxin HipraGumboro-GM97 cho gà uống với liều: 1 liều vicxin/gà
Lô đối chứng : Không sử dụng vacxin HipraGumboro-GM97
Sau đó theo dõi đàn gà trong thời gian 21 ngày. Chỉ tiêu an toàn của vacxin đ−ợc đánh giá dựa vào phản ứng của đàn gà, sự tăng trọng, tỷ lệ chết,...
3.5.2. Ph−ơng pháp theo dõi tăng trọng của gà
Cân gà vào các thời điểm 10 ngày, 31 ngày tuổi. Cân từng con một vào buổi sáng từ 7-8 giờ tr−ớc khi cho ăn, rồi lấy trị số trung bình.
Gà 10 ngày tuổi và 31 ngày tuổi cân bằng cân điện tử có độ chính xác 0,05g
3.5.3. Ph−ơng pháp đánh giá hiệu lực của vacxin bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc c−ờng độc
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 36
Lô thí nghiệm : ĐA dùng vacxin HipraGumboro-GM 97 với liều: 1 liều vacxin/gà
Lô đối chứng : Không dùng vacxin
Tiến hành công c−ờng độc cho đàn gà bằng chủng virus Gumboro c−ờng độc chuẩn CVL 52/70. Theo dõi đàn gà trong 10 ngày về triệu chứng lâm sàng, tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể của gà.
3.5.4. Ph−ơng pháp đánh giá hiệu lực của vacxin HipraGumboro-GM97 bằng phản ứng ELISA. bằng phản ứng ELISA.
ELISA là một trong những ph−ơng pháp quan trọng để xác định kháng thể Gumboro trong huyết thanh. Phản ứng ELISA có nhiều loại: Phản ứng ELISA trực tiếp và phản ứng ELISA gián tiếp. Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp ELISA gián tiếp để phát hiện kháng thể Gumboro trong huyết thanh của gà thí nghiệm
Nguyên lý chung
Thực chất của phản ứng ELISA sử dụng kháng thể hoặc kháng kháng thể có gắn enzyme cho kết hợp trực tiếp hay gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó cho cơ chất vào. Nếu kháng thể t−ơng ứng với kháng nguyên thì kháng thể hay kháng kháng thể có gắn enzyme không bị rửa trôi. Enzyme sẽ giải phóng cơ chất tạo lên màu. Khi so màu bằng quang phổ kế sẽ định l−ợng đ−ợc mức độ của phản ứng.
Nguyên lý hoạt động của kit civtest avi ibd
CIVTEST AVI IBD hoạt động dựa trên nền tảng của kỹ thuật ELISA gián tiếp. Kháng nguyên đặc hiệu của virus gây bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (virus gây bệnh Gumboro) đ−ợc gắn vào đáy giếng của 1 vỉ gồm 96 giếng. Khi ủ mẫu trong giếng kiểm tra, kháng thể đặc hiệu của virus Gumboro sẽ gắn kết với kháng nguyên đA đ−ợc gắn ở đáy giếng và không bị rửa trôi sau hoạt động rửa để loại bỏ những thành phần không kết hợp. Tiếp theo,
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 37
conjugate đ−ợc thêm vào để kết hợp với mọi kháng thể của gà. Conjugate không kết hợp sẽ bị rửa trôi và cơ chất đặc hiệu với enzyme đ−ợc thêm vào. Màu của hỗn dịch xuất hiện ở mỗi giếng t−ơng ứng với l−ợng kháng thể đặc hiệu đối với virrut Gumboro của gà hiện diện trong mẫu đ−ợc pha loAng.
THàNH PHầN KIT
Sản phẩm Số l−ợng
Vi bản 96 giếng (trong 8 dAi) có gắn kháng nguyên đặc
hiệu của IBDV 5
Lọ số 0: Dung dịch rửa (x 10) 2 x 100 ml
Lọ số 1: Chất pha loAng mẫu (x 10): chất pha loAng mẫu
đậm đặc có chứa thuốc nhuộm xanh lá cây 125 ml
Lọ số 2: Dung dịch conjugate: Dung dịch Horseradish peroxidase dán nhAn (rabbit anti –chicken IgY) có chứa thuốc nhuộm đỏ. Sử dụng ngay
30 ml
Lọ số 3: Dung dịch nền: Dung dịch ABTS. Sử dụng ngay 30 ml
Lọ số 4: Dung dịch STOP: Dung dịch acid oxalic. Sử dụng
ngay 30 ml
Lọ số 5: Đối chứng d−ơng: huyết thanh đối chứng d−ơng đ−ợc pha loAng tr−ớc có chứa thuốc nhuộm vàng. Sử dụng ngay
2.2 ml Lọ số 6: Đối chứng âm: huyết thanh đối chứng âm đ−ợc pha
loAng tr−ớc chứa thuốc nhuộm xanh d−ơng. Sử dụng ngay 2.2 ml
Bìa dính vi bản 5
H−ớng dẫn sử dụng Kit (insert) 1
Chứng nhận phân tích 1
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 38
methylisothiozolone và bromonitrodioxane. Nguyên vật liệu cần đ−ợc chuẩn bị thêm:
Tủ ấp 37oC, pipette đơn và nhiều rAnh chính xác với các đầu gắn pipette chỉ sử dụng 1 lần, bản pha loAng dùng để pha loAng mẫu, bảng đọc 96 giếng, n−ớc cất hoặc tiệt trùng và thiết bị rửa vi bản.
TIếN HàNH TEST
- Để thuốc thử ở nhiệt độ phòng và đA trộn đều chúng bằng máy lắc
- Ghi chép mẫu và các vị trí đối chứng trên một tờ giấy tạm 12x8. Các đối chứng âm và d−ơng phải đ−ợc chạy hai lần.
1. Nhỏ 50 àl đối chứng và 50 àl dung dịch mẫu đA pha loAng ở tỷ lệ 1/500 vào các giếng theo đúng sơ đồ đĩa ELISA
2. Đậy vỉ bằng bìa dính và ủ 30 phút ở +37oC.
3. Lấy bìa dính ra và rửa vỉ 3 lần với dung dịch rửa đA pha loAng (300 àl
cho 1 giếng). Xoay ng−ợc và làm khô kỹ l−ỡng trên giấy thấm. 4. Thêm 50 àl dung dịch conjugate (lọ số 2) vào mỗi giếng. 5. Đậy vỉ bằng bìa dính và ủ 30 phút ở +37oC.
6. Lấy bìa dính ra và rửa vỉ 3 lần với dung dịch rửa đA pha loAng (300 àl
cho 1 giếng). Làm khô nh− h−ớng dẫn trên.
7. Thêm 50 àl dung dịch abts vào mỗi giếng. Lắc đều vỉ trong 2 giây. 8. Đậy vỉ bằng bìa dính và thúc đẩy phản ứng tạo màu trong vòng 30 phút
ở +37oC ở nơi tối
9. Lấy bìa dính ra và thêm 50 àl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng. Trộn đều bằng cách lắc nhẹ mặt vỉ.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 39
* L−u ý
- Thẩm định test: Test có giá trị khi giá trị trung bình OD405 của đối chứng d−ơng > 0.5 và tỷ lệ (giá trị trung bình OD405 của đối chứng d−ơng/giá trị trung bình OD405 của đối chứng âm) > 6.0
- DIễN GIảI KếT QUả
Để diễn giải kết quả cần phải có chỉ số S/P (Sample value related to Positive value – Giá trị mẫu có liên quan đến giá trị d−ơng tính). Sử dụng công thức sau (sử dụng giá trị hấp thu trung bình cho đối chứng):
OD405 mẫu IBD– Giá trị trung bình OD405 của đối chứng âm
S/P = [ ]
Mẫu OD405 của đối chứng d−ơng – Giá trị trung bình OD405 của đối chứng âm
Tính toán hiệu giá: Hiệu giá log10 = 1.35 x Log10S/P + 3,425 Hiệu giá = antilog (hiệu giá Log10)
Giá trị S/P Hiệu giá IBD Tình hình kháng thể IBD
Thấp hơn 0.183 0 - 268 Âm tính Lớn hơn 0.183 và thấp hơn 0.226 269 - 356 Nghi ngờ Lớn hơn hoặc bằng 0.226
357 hoặc lớn hơn D−ơng tính
Thấp hơn 0.484 0 - 1000 Trong phạm vi ở thời điểm
chủng ngừa có thể không bị ảnh h−ởng của kháng thể mẹ truyền. Tùy thuộc vào vaccin đ−ợc sử dụng*
Lớn hơn hoặc bằng 0.484
1001 hoặc lớn hơn Nhìn chung là quá cao trong lần chủng ngừa đầu tiên
* Vaccin ở hầu hết các dòng cấp độ vừa chỉ có hiệu quả khi hiệu giá kháng thể mẹ truyền (MDA) thấp hơn 500 hoặc bằng 250.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 40
tiến trình test
1- Mẫu đối chứng và mẫu test 2- ủ +37 ºC 30 phút 3- Rửa (3 lần) 4- Dung dịch Conjugate 5- ủ +37 ºC 30 phút 6- Rửa (3 lần) 7- Dung dịch substrate 8- ủ trong tối Nhiệt độ phòng 30 phút 9 Dung dịch stop 10- Đọc kết quả (405 nm)
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 41
Sơ đồ đĩa ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N N 7 7 B P P C 1 1 D 2 2 E 3 3 F 4 4 G 5 5 H 6 6 46 46 3.5.5. Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thu đ−ợc từ kết quả nghiên cứu, đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp thống kê sinh học (Ngô Nh− Hoà, 1981) và sử dụng ch−ơng trình Excel trên máy vi tính.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 42