- Mổ khám kiểm tra bệnh tích ñại thể ở lợn mắc PRRS Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý vi thể ở lợn mắc PRRS
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
- Các phương pháp chẩn ựoán lâm sàng thường quy và mổ khám bệnh tắch (Hồ Văn Nam, 1982) [10], (Hồ Văn Nam và cs, 1996) [9], (Hồ Văn Nam và cs, 1996) [11] và (Chu đức Thắng và cs, 2008) [19].
- Kết quả phân lập, giám ựịnh virus trong phòng thắ nghiệm. *) Phân lập virus trên môi trường tế bào MARC145
Quy trình phân lập: Chuẩn bị: - Cối chày sứ, hạt thạch anh. - Kéo cắt tổ chức - Ống li tâm. - Ống eppendorf - Lọc Millipor 0,2 / 0,45 ộm.
- Môi trường duy trì ( EMEM + 5% FCS). Chuẩn bị bệnh phẩm gây nhiễm tế bào:
- Huyết thanh qua lọc.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ
xxxviii
- Thêm 20 ml môi trường duy trì. - đông tan 3 lần (bệnh phẩm cũ). - Li tâm 3000 vòng/phút.
- Lọc dịch ựã pha trên qua lọc minipore 0,45 ộm. Gây nhiễm tế bào MARC145
- Tế bào vừa phủ khoảng 90% chai nuôi tế bào T25 hoặc T75. - Bỏ môi trường ựang có trong bình, rửa 1 lần bằng PBS lượng 2ml. - Thêm vào 5 ml huyễn dịch virus
- đặt bình nằm trong tủ 37oC trong 1 giờ.
- Loại bỏ huyễn dịch virus rửa 1 lần lượng 2 ml PBS. - Thêm 10ml EMEM duy trì.
- Nuôi trong tủ 5 - 10% CO2ở 37oC. Theo dõi hủy hoại tế bào do virus PRRS
Quan sát sự phát triển của tế bào trên kắnh hiển vi trong vòng 7 ngày. Thay môi trường nếu cần (1ngày/1lần) tế bào nhiễm virus thay ựổi hình thái: co tròn thành từng ựám sau ựó là tế bào không bám dắnh.
Thu huyễn dịch tế bào có chứa virus: Cất chai tế bào có virus vào tủ âm sau 1 giờ lấy ra giải ựông. Cho toàn bộ môi trường nuôi và tế bào vào ống Falcon 15ml, ly tâm, thu dung dịch ở trên và bỏ cặn tế bào.
Kiểm tra sự có mặt của virus bằng phương pháp RRT-PCR *) Phát hiện, giám ựịnh virus bằng phương pháp RRT-PCR Xử lý bệnh phẩm:
Các phủ tạng ựược nghiền trong cối chày sứ vô trùng, pha thành huyễn dịch 1:10 với nước sinh lý (hoặc PBS pH 7,2) có kháng sinh (Penicillin 2000UI/ml, Streptomycin 2mg/ml). Ly tâm lấy dịch nổi ựể chiết tách RNA.
Chiết tách RNA:
Các mẫu bệnh phẩm nên chiết tách bằng kắt, khi sử dụng nên theo hướng dẫn của nhà sản xuất (có thể sử dụng bộ kắt Qiagen Rneasy Extraction cat #74104 50 prep hoặc #74106 250 prep theo quy trình dưới ựây).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ xxxix
Ớ Nhỏ 500ộl huyễn dịch phủ tạng vào ống ly tâm loại 1,5 ml cộng với 500ộl Qiagen
buffer RLT có 1% β-ME, lắc ựều trên máy Votex
Ớ Ly tâm nhẹ rồi thêm 500ộl cồn ETOH 70% (ethanol) vào ống, lắc mạnh bằng máy Votex
Ớ Ly tâm mẫu ựã bị dung giải trong 5 phút ở tốc ựộ 5000xg ở nhiệt ựộ phòng;
Ớ Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây tốc ựộ ≥ 8000xg ở nhiệt ựộ phòng;
Ớ Bổ sung 700ộl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ≥ 8000xg, thay ống thu mới vào cột lọc;
Ớ Nhỏ 500ộl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥ 8000xg, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer, thay ống thu mới;
Ớ Ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 phút ở tốc ựộ tối ựa, bỏống thu;
Ớ đặt cột lọc vào ống thu RNA, nhỏ 50 ộl RNase free H2O vào cột lọc, ủở nhiệt ựộ phòng trong ắt nhất 1 phút. Tách RNA bằng cách ly tâm trong 1 phút ở 10000vòng/phút, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu RNA;
Ớ Bảo quản mẫu RNA thu ựược ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RRT-PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở - 200C hoặc nhiệt ựộ thấp hơn.
Tiến hành phản ứng RRT-PCR:
- Công thức pha: Công thức này có thể thay ựổi cho phù hợp với từng loại primer và từng loại kắt RRT-PCR khác nhau. Thông thường hiện nay dùng 2 bộ kit.
+ Công thức áp dụng cho kắt RRT-PCR 1 bước của hãng Qiagen.
H2O 10,5 ộl
5X reaction mix 5 ộl
MgCl2 1,2 ộl
dNTP 0.8ộl
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ xl Primer forward 0,5 ộl Primer reverse 0,5 ộl Probe 0.5 ộl Mẫu RNA 5 ộl Tổng cộng 25 ộl
+ Công thức áp dụng cho kắt RRT-PCR của hãng Invitrogen
H2O 5,5 ộl 2X Reaction buffer 12,5 ộl Enzyme mix 0,5 ộl Primer forward 0,5 ộl Primer reverse 0,5 ộl Probe 0,5 ộl Mẫu RNA 5 ộl Tổng cộng 25 ộl - Tiến hành phản ứng:
đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR bằng phần mềm trên máy vi tắnh. Nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu ựối chứng dương tắnh, âm tắnh vào phần ký hiệu mẫu trong bảng kết quả. Lưu chương trình chạy máy. Cài ựặt chương trình phân tắch dữ liệu cho máy chu kỳ nhiệt Cepheid Smart Cycler hoặc Biorad IQ5 và chạy chương trình.
Bảng 3.1. Chu kì nhiệt của phản ứng RRT-PCR
Kit Quá trình Nhiệt ựộ (oC) Thời gian Số vòng
50 30 phút RT 95 15 phút 1 95 10 giây Qiagen one-step PCR 58 50 giây 40 50 15 phút RT 95 2 phút 1 95 10 giây Invitrogen superscript 3 PCR 58 50 giây 40
- Phân tắch kết quả xét nghiệm: Các giá trị mặc ựịnh ựã ựược thiết lập ựể phát hiện virus PRRS. Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 ựược coi là dương tắnh. Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 - 40 ựược coi là nghi ngờ. Mẫu không có Ct ựược coi là âm tắnh. Những bệnh phẩm này cần ựược xác chẩn bằng phương pháp phân lập virus trước khi có kết luận chẩn ựoán cuối cùng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ xli
- đối chứng dương tắnh RNA ựã sao mã ựược pha loãng ở hàm lượng sử dụng cho giá trị Ct
khoảng 25. Khi ựối chứng có Ct cao hơn 29 thì phải làm lại ựể xét nghiệm ựảm bảo. Nếu Ct
của ựối chứng dương tắnh thấp hơn 20, nên chuẩn ựộ lại ựộ pha loãng của ựối chứng. Bất kỳ thời ựiểm nào Ct của ựối chứng dương tắnh hoặc ựường cong tăng trưởng khác thấp hơn 14, giá trị trừ nền có thể bị sai lệch. Mẫu ựối chứng dương tắnh phải có giá trị Ct nhưựã biết (ổ 2 Ct) và mẫu ựối chứng âm tắnh phải có Ct = 0 thì kết quả RRT-PCR mới ựược công nhận. - Kết hợp cùng các dấu hiệu triệu chứng lâm sàng và bệnh tắch ựại thể một số ca bệnh ựi mổ khám tại thực ựịa, các báo cáo tình hình gửi kèm mẫu bệnh phẩm.
Dựa vào phương pháp mổ khám lợn và phương pháp xét nghiệm vi thể theo Tài liệu tiêu chuẩn ngành Ờ Cục Thú y, 2006.
*) Phương pháp mổ khám lợn Chuẩn bị mổ khám.
- Bộựồ mổ gia súc ựã ựược vô trùng
- Các trang thiết bị bảo hộ cho cán bộ mổ khám (Quần áo bảo hộ, găng tay, ủng, kắnh, khẩu trangẦ)
- Dụng cụ lấy mẫu ựã ựược vô trùng
- Hoá chất: Cồn Metanon (Methanol), cồn Etanon (Ethanol) 960, focmandehyt (Formaldehyde), glyxerin (Glycerine), natri xitrat (Natri citrat), magiê sunfat (Magesium sulfate).
Tiến hành mổ khám:
- Nếu con vật còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến ựổi lớn về mức ựộ quan sát bệnh tắch (dùng ựiện, chọc tiết, thuốc gây mê...).
- Cán bộ tham gia mổ khám phải mang ựầy ựủ các trang thiết bị bảo hộ ựã ựược chuẩn bị trước.
- Trường hợp các ca bệnh nghi có thể lây sang người tuyệt ựối không ựược mổ khám. Kiểm tra bên ngoài: Thể trạng, da, lông, các khối u, các lỗ tự nhiên, các khớp, ngoại ký sinh trùng và các tổn thương khác.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ xlii
đặt lợn nằm trên bàn mổ dùng dao cắt các cơ trong nách tới khớp xương bả vai, cắt các cơ trong bẹn tới khớp hông ở cả hai bên chân. Bẻ gập chân sang hai bên cho lợn nằm ngửa trên bàn.
Dùng dao rạch lớp da và cơ từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiếp lớp sụn xương ức ở hai bên lật xương ức, kéo dài tới cơ hai bên thành bụng ựể bộc lộ toàn bộ các tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng.
Quan sát những biến ựổi bên ngoài các tổ chức về màu sắc, kắch thước, hình dáng, các biến ựổi bất thường.
Lấy máu tim và các tổ chức nội tạng cho nuôi cấy xét nghiệm.
Dùng dao cắt các cơ hai bên cằm giữ lưỡi, kéo lưỡi ra khỏi xoang miệng, kiểm tra xoang miệng.
Cắt tách lưỡi, thực quản, khắ quản, phổi, cuối cùng cắt ựứt thực quản, mạch quản giáp với cơ hoành (trước khi cắt thực quản dùng dây buộc chặt phắa dưới tránh thức ăn trào ra từ phắa dạ dày). Kéo toàn bộ hệ thống dạ dày ruột ra ngoài kiểm tra sau cùng tránh gây nhiễm bẩn. Lấy các tổ chức trong cổ, ngực rửa nước sạch trước khi kiểm tra chi tiết bên ngoài.
Kiểm tra màng, dịch xoang bao tim, mở kiểm tra cơ, van, chân cầu bên trong tim. Kiểm tra hạch amidan, rạch thanh quản, khắ quản, phế quản, phế nang phổi kiểm tra bên trong về màu sắc và ựộựàn hồi.
Rạch kiểm tra bên trong thực quản.
Lấy gan, mật, lá lách ra ựể kiểm tra về màu sắc, kắch thước, ựộ cứng mềm, ký sinh trùng và các tổn thương khác.
Kiểm tra tuyến tuỵ.
Cắt ựứt da, cơ dọc theo khớp bán ựộng háng, dùng mũi dao tách rời khớp bán ựộng háng, bộc lộ xoang chậu.
Kiểm tra toàn bộ cơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng, dạ con ở con cái, dịch hoàn, ống dẫn tinh ở con ựực) cả bên ngoài và bên trong.
Tách vỏ thận, kiểm tra bên ngoài và bổ ựôi kiểm tra bên trong thận, ống dẫn niệu, bóng ựái kiểm tra về màu sắc kắch thước, chất chứa bên trong.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ xliii
Rạch kiểm tra bên trong hệ thống tiêu hoá theo thứ tự từ dạ dày tới hậu môn loại bỏ chất chứa quan sát bề mặt niêm mạc ựặc biệt chú ý tới vùng van hồi manh tràng về các chất chứa, dịch, màu sắc, ựiểm hoại tử, xuất huyết.
Cắt kiểm tra dịch khớp, mặt khớp, màu sắc các khớp xương, chẻ dọc kiểm tra tuỷ xương bên trong.
Cắt ựầu lợn ởựốt sống Atlas, lột da, dùng ựục hoặc cưa cắt từ lỗ chẩm sang hai bên ựến cạnh trước xương trán, lật xương hộp sọ, bộc lộ não. Dùng kéo cong vô trùng tách màng não, cắt ựứt các dây thần kinh lấy não. Tuyến yên cũng ựược kiểm tra.
Dùng cưa cắt ngang xương mũi ựể kiểm tra xoang và các ống cuộn. Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu cho xét nghiệm trong phòng thắ nghiệm. Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm.
Xử lý hấp tiêu ựộc xác hoặc thiêu ựốt, chôn lấp xử lý vôi bột.
- Các mẫu ựồng thời cũng ựược cốựịnh trong formalin 10% ựể làm xét nghiệm bệnh tắch vi thể.
*) Phương pháp làm tiêu bản xét nghiệm bệnh tắch vi thể
Các mẫu phủ tạng cắt mỏng 0,5cm (nhỏựể nguyên) ngâm trong dung dịch formalin 10% trong 24 giờ.
Lấy các miếng tổ chức cố ựịnh trong formalin ra cắt mỏng 2 - 3mm, rửa dưới vòi nước chảy trong 2 Ờ 3 giờ.
Chuyển sang ngâm trong cồn 700 thời gian 2 Ờ 3 giờ. Ngâm sang cồn 900 trong 2 Ờ 3 giờ.
Ngâm sang cồn tuyệt ựối 2 Ờ 3 giờ. Ngâm sang xylen 1 ựể trong 2 Ờ 3 giờ. Ngâm sang xylen 2 ựể trong 2 Ờ 3 giờ. Ngâm tẩm nến 3 lần, mỗi lần 2 Ờ 3 giờ. đúc khuôn.
Cắt tiêu bản:
Cắt gọt khối block nến vuông, mặt cắt bằng phẳng, ựể trên mặt khay ựá lạnh khoảng 5 Ờ 10 phút.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ xliv
Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi chưng cất nhiệt ựộ nước 30 - 350C; Dùng lam kắnh chọn lát cắt giãn phẳng, không nhăn nheo vớt, dựng nghiêng, ựể vào tủấm 370C cho khô.
Nhuộm tiêu bản H&E:
để các tiêu bản vào tủấm 600C trong vòng 30 phút cho nến tan chảy. Lấy ra tẩy nến trong xylen 3 lần, mỗi lần 3 Ờ 5 phút.
Ngâm trong cồn tyuyệt ựối 3 Ờ 5 phút. Ngâm sang cồn 900ựể 3 Ờ 5 phút. Ngâm sang cồn 700ựể 3 Ờ 5 phút. Rửa dưới vòi nước chảy 3 Ờ 5 phút.
Ngâm trong thuốc nhuộm Haematoxylin 1 Ờ 2 phút. Rửa dưới vòi chảy 3 Ờ 5 phút.
Ngâm trong thuốc nhuộm Eosin 60 Ờ 90 giây.
Rửa dưới vòi nước chảy 2 Ờ 3 phút, chú ý màu Eosin.
để khô trong nhiệt ựộ phòng (hoặc ngâm trong cồn 900 và cồn tuyệt ựối), chuyển sang xylen 2 lần (mỗi lần 2 Ờ 3 phút), gắn lamen bằng Balm canada. để khô, soi kắnh. Soi kiểm tra dưới kắnh hiển vi quang học: Từ vật kắnh có ựộ phóng ựại thấp ựến vật kắnh có ựộ phóng ựại cao.