3. NỘI DUNG, NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3.4Phương phỏp xỏc ủị nh khả năng ủ ỏp ứ ng miễn dịch của vịt sau kh
ủược tiờm vacxin Viờm gan vịt
Khả năng ủỏp ứng miễn dịch của vịt sau khi tiờm phũng vacxin ủược thể hiện qua hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh. Chỳng tụi sử dụng phản
ứng trung hũa trờn phụi trứng gà với phương phỏp huyết thanh pha loóng và virut cố ủịnh. Phương phỏp này thường dựng ủể kiểm tra hàm lượng khỏng thể cú trong huyết thanh của vịt sau khi ủược tiờm phũng vacxin. ðể thực hiện phản ứng trung hũa cần phải chuẩn bị:
- Khỏng thể là huyết thanh của vịt ủó ủược tiờm phũng vacxin Viờm gan vịt.
- Khỏng nguyờn là virut Viờm gan vịt chuẩn.
- Huyết thanh thường làm ủối chứng (ủó xử lý ủể diệt bổ thể ở
560C/30’)
3.3.4.1 Phương phỏp chế huyết thanh miễn dịch chuẩn (khỏng huyết
thanh)
Dựng 20 vịt con từ 1-5 ngày tuổi chia thanh 2 lụ: lụ thớ nghiệm và lụ ủối chứng, mỗi lụ 10 con.
- Lụ thớ nghiệm: Tiờm vacxin Viờm gan vịt với liều sử dụng, mỗi con 0,5ml. Sau 21 ngày lấy mỏu, bảo quản trong tủ lanh 40C/12-24h chắt lấy huyết thanh.
- Lụ ủối chứng: khụng tiờm vacxin, cũng sau 21 ngày lấy mỏu chắt huyết thanh làm phản ứng so sỏnh kết quả với lụ thớ nghiệm.
3.3.4.2 Phương phỏp làm phản ứng trung hũa (virut cố ủịnh, huyết thanh
thay ủổi)
- Chuẩn bị trứng: Trứng gà cú phụi 10 ngày tuổi, soi trứng, chọn những phụi khoẻ mạnh, ủỏnh dấu buồng hơi, ủỏnh dấu vị trớ ủầu phụi, sỏt trựng bằng cồn 700 xung quanh vỏ trứng, sỏt trựng vị trớ buồng hơi bằng cồn iod 5% .
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 51
- Huyết thanh miễn dịch ủược xử lý ở 56oC/30 phỳt ủể loại bỏ cỏc yếu tố trung hoà khụng ủặc hiệu và pha loóng với nước muối sinh lý 0,85% thành cỏc ủộ pha loóng 1/2, 1/4…, 1/128, 1/256.
- Pha loóng huyễn dịch virut Viờm gan vịt tương ủương 100EID50/0,1ml.
- Trộn huyết thanh với huyễn dịch virut theo theo tỷ lệ 1:1 (vớ dụ: trộn 0,1ml huyết thanh với 0,1ml huyễn dịch virut), sau ủú ủể ủ ở 37oC trong 45 phỳt ủến 1 giờ ủể virut tiếp xỳc với khỏng thể trong huyết thanh rồi tiờm cho phụi gà. Mỗi ủộ pha loóng huyết thanh tiờm cho 5 phụi, mỗi phụi 0,1ml; theo dừi trong 96 giờ. Hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh ủược biểu diễn thụng qua hiệu giỏ khỏng thể và ủơn vị trung hoà (ðVTH). Hiệu giỏ khỏng thể chống virut là ủộ pha loóng lớn nhất của huyết thanh ngăn cản hoàn toàn sự gõy chết phụi.
ðộ pha loóng của huyết thanh
Virut Số ống 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1 0,1ml 2 0,1ml 3 0,1ml 4 0,1ml 5 0,1ml 6 0,1ml 7 0,1ml Virut pha loóng tương ủương 100 EID50 mỗi ống 0,1ml 8 0,1ml
Sơủồ 3.1. Sơủồ phản ứng trung hũa virut cốủịnh, huyết thanh pha loóng
ðơn vị trung hoà ủược tớnh như sau:
Nếu trộn 0,1ml huyết thanh với 0,1ml virut ở nồng ủộ 100EID50 sẽ làm cho thể tớch tăng lờn gấp ủụi nờn nồng ủộ giảm xuống 1 nửa là 50EID50 và trong 0,1ml huyễn dịch cú 0,05ml virut và 0,05ml huyết thanh.
Nếu lượng khỏng thể trung hũa cú trong huyết thanh thớ nghiệm trung hũa ủược 1 EID50 (LD50, TCID50) virut ở thể tớch tương ủương thỡ trong mẫu
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 52
huyết thanh ủú chứa 1 ủơn vị trung hũa. Vớ dụ: hiệu giỏ khỏng thểủạt ủược là 1/4 tức là 0,1 ml huyết thanh ở ủộ pha loóng 1/4 trung hoà hết 0,1ml virut chứa 50EID50 (LD50, TCID50), cú nghĩa là 0,1ml huyết thanh ở ủộ pha loóng 1/4 cú chứa 50 ðVTH, như vậy trong 0,1 ml huyết thanh ủặc sẽ cú 50 x 4 = 200 (ðVTH), do ủú 1ml huyết thanh ủặc chứa 200 x 10 = 2000 (ðVTH). Nếu mẫu huyết thanh thớ nghiệm trung hũa ủược từ 50 ðVTH trở lờn, phản ứng trung hũa là dương tớnh. Tuy nhiờn, ủể bảo hộ ủược ủộng vật, hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh miễn dịch phải càng cao càng tốt và tựy thuộc vào từng trường hợp.