3. NỘI DUNG, NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3 Phương phỏp nghiờn cứu 1 Quy trỡnh sản xuấ t vacxin
Ấp tiếp ở 370C/96 giờ Giống gốc
Pha với nước sinh lý thành nồng ủộ 10-2
Bỏn thành phẩm
Kiểm tra vụ trựng Thu hoạch thai trứng
Mổ trứng
Thu trứng ủể lạnh 40C 8-24h
Gõy nhiễm phụi trứng Kiểm tra vụ trựng
Giống sản xuất
Chuẩn ủộ hiệu giỏ
Ra chai ủụng khụ
Dỏn nhón, bảo quản Kiểm nghiệm ðụng khụ theo quy trỡnh
Kiểm tra hiệu giỏ virus
Xay lọc bỏn thành phẩm + chất bổ trợ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 46
3.3.2 Phương phỏp khảo sỏt xỏc ủinh chỉ số ELD50 (liều gõy chết 50% phụi
) và EID50 (liều gõy nhiễm 50% phụi)
3.3.2.1 Phương phỏp xỏc ủịnh chỉ số ELD50( Embryo lethal dose fifty
percent)
- Chuẩn bị trứng gà cú phụi 10 ngày tuổi: trứng gà Lơgo sạch bệnh
ủược lau sạch ấp ở nhiệt ủộ 380C, sau 5 ngày soi thải những quả vụ tinh và chết thai. ðến ngày thứ 10 tiếp tục soi thải những trứng bị chết thai, ủỏnh dấu vị trớ buồng hơi và ủầu thai.
- Chuẩn bị virut vacxin: giống virut Viờm gan vịt typ I ủược pha loóng bằng nước muối sinh lý 0,85% ở 6 nồng ủộ từ 10-1ủến 10-6. Xử lý khỏng sinh
ủể diệt tạp khuẩn.
- Gõy nhiễm vào xoang niờu nang mỗi quả 0,2ml huyễn dịch giống virut ủó ủược pha ở cỏc nồng ủộ trờn (tiến hành trong phũng cấy vụ trựng), mỗi nồng ủộ gõy nhiễm cho 5 quả, cho trứng vào tủ ấp tiếp ở 370C. Riờng 5 phụi ủối chứng khụng tiờm virut.
- Theo dừi: cứ 24h, 48h, 72h, 96h sau khi tiờm kiểm tra loại bỏ phụi chết trước 24h. Ghi thời gian phụi chết ủến 96h.
- Mổ trứng: sau 96h ủem mổ tất cả trứng ở lụ thớ nghiệm và lụ ủối chứng ủể quan sỏt bệnh tớch của phụi.
- Ghi số phụi chết cú bệnh tớch theo mỗi nồng ủộ pha loóng. Tớnh tỷ lệ phụi chết theo cụng thức:
- Tớnh toỏn liều gõy chết tối thiểu 50% phụi (ELD50) theo cụng thức của Reed-Muench.
LgELD50 = LgA + Xlgf
Tổng số phụi chết + tổng số phụi sống Tổng số phụi chết
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 47
A'-50 X = A'-B' Trong ủú:
X: Khoảng cỏch tỷ lệ
A: ðộ pha loóng virut gõy chết phụi cận trờn 50%. A’: Tỷ lệ % chết phụi cận trờn 50%
B’: Tỷ lệ % chết phụi cận dưới 50% f: Bậc pha loóng virut (10-1)
- Tiến hành thớ nghiệm như trờn với mỗi thớ nghiệm làm lặp lại nhiều lần, tớnh chỉ số ELD50 trung bỡnh.
3.3.2.2 Phương phỏp xỏc ủịnh chỉ số EID50 (Embryo infective dose fifty
percent).
- Chuẩn bị phụi trứng gà cú phụi 10 ngày tuổi, giống virut Viờm gan vịt type I ủược pha loóng bằng nước muối sinh lý 0,85% ở 9 nồng ủộ tư 10-1 ủến 10-9. Cỏch bố trớ thớ nghiệm ,tiờm trứng, theo dừi, như thớ nghiệm ở phần 3.4.1.
- Mổ trứng: ủem mổ tất cả trứng ở lụ thớ nghiệm và lụ ủối trứng ủể
quan sỏt bệnh tớch của phụi.
- Ghi số phụi cú bệnh tớch, khụng cú bệnh tớch (so sỏnh với phụi ủối chứng) ở mỗi nồng ủộ pha loóng giống virut.
- Bệnh tớch cần theo dừi ủểủỏnh giỏ do nhiễm virut là: màng sưng dày, phụi xuất huyết, phự phụi, gan phụi xuất huyết.
- Tớnh toỏn liều gõy nhiễm tối thiểu 50% (EID50) theo cụng trức của Reed- Muench.
3.3.3 Phương phỏp kiểm tra chất lượng vacxin:
Bao gồm kiểm tra vụ trựng, kiểm tra an toàn, kiểm tra hiệu lực (cỏc kiểm tra này dựa trờn tiờu chuẩn ngành quy ủịnh).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 48
3.3.3.1 Phương phỏp kiểm tra vụ trựng (Theo 10 TCN 161-92)
a. Lấy mẫu
Áp dụng lấy mẫu theo TCN 160-92 ”Vacxin thỳ y- Quy trỡnh lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiệm”. mỗi lụ vacxin lấy 2% số thành phẩm (tối thiểu 5 mẫu, tối ủa 20 mẫu).
b. Kiểm tra vụ trựng
- Pha vacxin trở lại dạng ban ủầu.
- Cấy huyễn dịch trờn vào cỏc mụi trường quy ủịnh (Thạch mỏu, thạch nấm, nước thịt, nước thịt gan yếm khớ), mỗi loại mụi trường lấy 2 ống. cỏc mụi trường trờn ủược chế theo quy ủịnh thụng dụng ủể phỏt hiện cỏc vi khuẩn dung huyết, hiếu khớ, yếm khớ và nấm cú trong vacxin.
- Lượng vacxin cấy kiểm tra bằng 1-2% dung tớch mụi trường.
- Mụi trường ủó cấy kiểm tra, ủem bồi dưỡng ở 370C theo dừi 7 ngày, riờng thạch nấm ủể ở nhiệt ủộ phũng (25-300C). Kết quả kiểm tra ủược ỏp dụng theo tiờu chuẩn TCN 161-92 của cục thỳ y .
Vacxin ủược xem ủạt tiờu chuẩn khi cỏc mụi trường kiểm tra khụng cú vi khuẩn nào mọc trong thời gian theo dừi, ủối với vacxin ủụng khụ ủược phộp cú 1 khuẩn lạc hiếu khớ khụng dung huyết trong 1 liều sử dụng.
3.3.2.2 Phương phỏp kiểm tra chỉ tiờu an toàn( theo 10 TCN 894-2006)
Tiờm dưới da hoặc bắp thịt cho 20 vịt con 1-3 ngày tuổi, mỗi con ủược tiờm 10 liều vacxin quy ủịnh.Theo dừi 14 ngày, tất cả vịt phải sống khỏe.
3.3.2.3 Phương phỏp kiểm tra hiệu lực (2 phương phỏp)
3.3.2.3.1 Phương phỏp trọng tài
Tiờm huyễn dịch cho 20 vịt con 1-3 ngày tuổi (tiờm dưới da). Sau 72 giờ, cỏc vịt miễn dịch cựng với 20 vịt ủối chứng ủược thử thỏch với virut Viờm gan vịt cường ủộc liều 103 LD50 (tiờm dưới da). Theo dừi 10 ngày, lụ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 49
vacxin ủạt tiờu chuẩn nếu ớt nhất 70% vịt ủược tiờm vacxin sống và ớt nhất 70% vịt ủối chứng chết.
3.3.2.3.2 Phương phỏp thay thế
- Tiến hành thớ nghiệm :
Chuẩn bị trứng gà cú phụi 8-10 ngày tuổi: trứng gà Lơgo sạch bệnh ủược lau sạch ấp ở nhiệt ủộ 380C, sau 5 ngày soi thải những quả vụ tinh và chết thai.
ðến ngày thứ 10 tiếp tục soi thải những trứng bị chết thai, ủỏnh dấu vị trớ buồng hơi và ủầu thai.
- Chuẩn bị giống virut: giống virut Viờm gan vịt typ I ủược pha loóng bằng nước muối sinh lý 0,85% ở 6 nồng ủộ từ 10-1
ủến 10-6. Xử lý khỏng sinh
ủể diệt tạp khuẩn.
- Gõy nhiễm vào xoang niờu nang mỗi quả 0,2ml huyễn dịch giống virut ủó ủược pha ở cỏc nồng ủụ trờn (tiến hành trong phũng cấy vụ trựng), mỗi nồng ủộ gõy nhiễm cho 5 quả, cho trứng vào tủ ấp tiếp ở 370C. Riờng 5 phụi ủối chứng khụng tiờm virut.
- Theo dừi: cứ 24h, 48h, 72h, 96h sau khi tiờm kiểm tra loại bỏ phụi chết trước 24h. Ghi thời gian phụi chết ủến 96h.
- Mổ trứng: sau 96h ủem mổ tất cả trứng ở lụ thớ nghiệm và lụ ủối chứng ủể quan sỏt bệnh tớch của phụi.
- Ghi số phụi chết cú bệnh tớch theo mỗi nồng ủộ pha loóng.
- Vacxin ủạt hiệu lực nếu mỗi liều sử dụng chứa ớt nhất 103,3ELD50
virut Viờm gan vịt.
x 100 Tổng số vịt ủược cụng
Số vịt sống sau khi cụng cường ủộc Tỷ lệ bảo hộ (%) =
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 50