tổ chức học
Xác ñịnh các giai ñoạn phát triển tuyến sinh dục cá theo phân loại của Sakun và Butskaia (1968) dựa trên lát cắt mô tế bào.
Phương pháp làm tiêu bản tuyến sinh dục ñược thực hiện dựa trên phương pháp của Sheckan và Hrapchack (1980) và quy trình làm tiêu bản mô học của Trung tâm Quan trắc và Cảnh báo Môi trường, Bệnh thủy sản- Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I.
Cố ñịnh mẫu tuyến sinh dục : Mẫu ñược cố ñịnh bằng dung dịch Bouin có thành phần như sau.
+ 750 ml dung dịch acid picric bão hòa. + 250 ml formalin 40%.
+ 50 ml acid axetic ñậm ñặc.
Ngâm mẫu trong 24h sau ñó ngâm trong nước từ 1-3h.
Khử nước ở mẫu cố ñịnh: Lần lượt ñưa mẫu qua cồn Etylic với các nồng ñộ khác nhau tăng dần.
+ Cồn 70%: 1 lần từ 30 - 60 phút. + Cồn 95%: 3 lần, mỗi lần 30 – 60 phút. + Cồn 100%: 3 lần, mỗi lần 30 - 60 phút.
Làm trong mẫu: Mẫu ñã khử nước và ñược làm bằng xilen + Xilen I: 1 lần trong 60 phút.
+ Xilen II: 1 lần trong 60 phút.
Thấm Parafin: mẫu ñã ñược làm trong chuyển vào Parafin ñun nóng ở nhiệt ñộ từ 56-580C trong 4h.
ðúc Parafin:
+ Sử dụng máy ñể ñổ Parafin ñã nóng chảy vào khuôn ñã có mẫu, sau ñó ñặt khuôn lên dàn lạnh cho Parafin ñông lại tạo ta khối Parafin chứa mẫu. Giữ mẫu ở một mặt khuôn ñể khi cắt ñược thuận tiện.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp………28
phần Parafin thừa và mặt của khối mẫu sâu vào 3-5 µm.
Cắt lát mẫu
+ Gắn khối Parafin chứa mẫu vào máy Microtom. + Tiến hành cắt những lát mô dày.
+ ðưa lát cắt vào nước ấm (40 - 50oC) khoảng 1-2 phút ñể lát cắt giãn, không bị nhăn.
+ Dùng slide (lam) ñể lấy lát cắt ra khỏi nước có miết qua albumin. + ðặt lên máy sấy slide ở nhiệt ñộ 40 - 60oC trong thời gian 1- 4 giờ.
Nhuộm Hematoxylin và Eosin
+ Loại bỏ Parafin ở lát cắt bằng Xilen I: 5 phút, Xilen II: 5 phút + Làm no mẫu nước:
• Cồn 100% : 2 lần 2 - 3 phút
• Cồn 95% : 2 lần 2 - 3 phút
• Cồn 80% : 2 lần 2 - 3 phút
• Cồn 50% : 1 lần 2 - 3 phút + Nhúng mẫu trong nước lã 3 - 6 lần.
Nhuộm Hematoxylin – Mayer: 4 - 6 phút
+ Rửa qua nước chảy nhẹ: 4 - 6 phút + Nhuộm Eosin: 2 - 3 phút
+ Làm mất nước:
• Cồn 95% : 2 - 3 phút
• Cồn 100% : 2 - 3 phút
+ Làm trong mẫu: Xilen I: 2 - 3 phút; Xilen II: 2 - 3 phút Dùng lamen sạch dán lên lam mẫu bằng Bouin Canada ñể bảo quản và quan sát mẫu dưới kính hiển vi ñiện tử.