3.2.1. Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng
Sử dụng phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng của Viện sĩ V.A Dogiel và bổ sung nghiên cứu của Hà Ký, Bùi Quang Tề (2007).
Hình 3.1. Khái quát nghiên cứu ký sinh trùng
Mẫu tôm
Kiểm tra phần phụ, mang, ruột, gan tụy
Quan sát bằng kắnh lúp, kắnh hiển vi Tiêu bản tươi Tiêu bản cố ựịnh
đo, ựếm, chụp ảnh, mô tả ựặc ựiểm
định danh KST
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 21
3.2.2. Phương pháp mô bệnh học
Quan sát sự biến ựổi về cấu trúc tế bào bị nhiễm vi bào tử của cơ quan gan tụy trong tôm bị bệnh phân trắng dưới kắnh hiển vi quang học dựa theo phương pháp của Lightner (1996). Quy trình xử lý mô học ựược tiến hành theo các bước như sau: Thu mẫu → Xử lý mẫu → đúc mẫu → Cắt mẫu → Nhuộm mẫu → đọc kết quả.
3.2.3. Phương pháp thu mẫu
- Quan sát các các ao nuôi tôm sú có hiện tượng phân trắng và những dấu hiệu bệnh lý bên trong và bên ngoài của tôm sú bị bệnh phân trắng.
- Thu mẫu các ao tôm bị bệnh phân trắng trong trường hợp tôm bị bệnh phân trắng. Chọn những con có dấu hiệu bệnh lý của bệnh phân trắng ựể nghiên cứu như: trong ao có các sợi phân trắng xốp nổi lên trên mặt nước, trong các sàng thức ăn và có các váng như váng dầu thường tập trung vào góc cuối hướng gió. Kiểm tra gan tôm thấy mềm nhũn và có màu trắng sữa, ruột tôm có màu trắng, bên trong có các giải phân ngắt thành từng ựoạn, không liên tục. Mẫu ựược phân tắch tại hiện trường và trong phòng thắ nghiệm.
- Thu mẫu các ao ựối chứng là những ao trong vùng nghiên cứu nhưng tôm không bị bệnh phân trắng, không có những dấu hiệu phân trắng như trên.
- Tôm dùng ựể nghiên cứu là tôm sống.
- Tiến hành ựo chiều dài và cân trọng lượng tôm nhanh chóng.
3.2.4. Dụng cụ, hóa chất cần thiết ựể giải phẫu và nghiên cứu ký sinh trùng
ký sinh trên tôm
* Dụng cụ
- Kắnh lúp; kắnh giải phẫu có thị kắnh: x7, x10, vật kắnh: x2, x4, x10; kắnh hiển vi có thị kắnh: x10, x15, vật kắnh: x10, x40, x100
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 22
nhớt, dao cán rời ựể rạch cơ, pinxet các loại, dùi nhọn giải phẫu, kéo các loại. - Các loại dụng cụ khác như: khay men, ựĩa petri, cốc thuỷ tinh nhỏ, ống thuỷ tinh nhỏ, chén thuỷ tinh nhỏ, lam kắnh và lamen.
- Máy cắt mô (microtom) và dụng cụ phục vụ cho nhuộm mô tế bào. - Lọ nhỏ cố ựịnh mẫu.
* Hoá chất:
- Cồn 50%, 70%, 90%, 96%, 100%, Niterat bạc (AgNO3), formol 4%, 10%, hematocyline, Gemsa, Gelatin - glycerin, nhựa Canada.
- Hóa chất ựể nhuộm mô tế bào:
+ Dung dịch cốựịnh Davidson
Cồn 95% 330ml Formalin (37% formaldehyde) 220 ml Nước cất 335ml Acid Acetic ựậm ựặc 115ml
+ Thuốc nhuộm Haematoxylin - Mayer (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Haematoxylin 2 gam Sodium Iodate Ờ NaI 0,4 gam Acid Citric 0,2 gam Chloral hydrate 100 gam Nước cất 1000 ml Postassium Alumnium sulphate 90,0gam
Hoà tan Haematoxylin trong nước cất sau ựó cho NaI và Posstasium Aluminium hoà tan, tiếp tục cho Acid Citric và Chloral hydrate.
+ Thuốc nhuộm Eosin Ờ Phloxine
Ethanol 95% 780ml
Dung dịch Eosin Y1 1% 100ml Dung dịch Phloxine B1 1% 100ml
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 23
Acid Acetic ựậm ựặc 5ml
Hoà tan Eosin trong cồn sau ựó thêm Acid Acetic. Trước khi hoà Eosin cho 2 Ờ 3 giọt Acid Acetic vào cồn 70%
- Cồn các nồng ựộ: 70%, 75%, 80%, 95%, 100% - Dung dịch Xylen - Parafin
- Thuốc nhuộm gram
+ Dung dịch 1: tắm tinh thể (Crystal violet)
2g Crystal violet + 20 ml cồn etylic 96% + 0,8 g Ammonium oxalate + 80ml nước cất. Hòa Crystal violet trong cồn; hòa ammonium oxalte trong nước cất, sau ựó trộn lẫn hai dung dịch, ựể yên sau 24h và lọc dung dịch.
+ Dung dịch 2: Lugol
1g Iod tinh thể + 2g KI + 300ml nước cất. Hòa tan KI trong khoảng 20ml nước, sau ựó cho Iod vào thêm nước cất vừa ựủ 300ml, ựể yên qua ựêm.
+ Dung dịch 3: cồn acetone
95ml cồn etylic 95% + 5ml acetone + Dung dịch 4: Safranin
6g Safranin 0,85% + 20ml cồn etylic 95% + 200ml nước cất. Hòa tan Safranin trong 20m cồn sau ựó cho thêm 200ml nước cất.
3.2.5. Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng
3.2.5.1. Kiểm tra ngoại ký sinh trùng
- Quan sát bằng mắt thường những dấu hiệu thay ựổi bên ngoài của tôm bị bệnh phân trắng
- Thu mẫu bên ngoài: cắt các phần phụ, mang của tôm. đặt lên lam kắnh, nhỏ vài giọt muối sinh lý, quan sát dưới kắnh hiển vi có ựộ phóng ựại 100 lần (10ừ10).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 24
3.2.5.2. Kiểm tra nội ký sinh trùng
- Giải phẫu tôm: Lấy ruột, gan tụy. Các mẫu này làm tiêu bản tươi sau ựó soi dưới kinh hiển vi ựộ phóng ựại 100 lần (10ừ10), 400 lần (40x 10), 1000 lần (100x 10)
- Lấy nhớt trong ruột, ựể riêng lên lam kắnh, thêm vào 1-2 giọt nước và quan sát dưới kắnh hiển vi. Ruột tôm lấy ra ựược cho vào lam kắnh (với ruột tôm nhỏ) hoặc cho vào một ựĩa lồng (với ruột tôm lớn). đặt lên kắnh giải phẫu, dùng hai kim tiêm chia ruột theo các phần trước, giữa, sau và ựể riêng mỗi phần ở các vị trắ khác nhau trên ựĩa lồng hoặc trên lam kắnh, cho vào mỗi vị trắ của ruột vài giọt nước muối có ựộ mặn của ao nuôi hoặc ựộ mặn 15- 30Ẹ. Dùng hai kim tiêm giải phẫu từng phần ruột, soi và ựếm toàn bộ ký sinh trùng có trong ruột.
- Lấy mẫu gan tụy phết mỏng lên lam kắnh ựể khô tự nhiên rồi nhuộm Gram hoặc cố ựịnh bằng cồn Methanol, sau ựó nhuộm Giemsa. Sau ựó tiến hành soi dưới kắnh hiển vi quang học (X100).
3.2.6. Cốựịnh, bảo quản và làm tiêu bản ký sinh trùng
* Cốựịnh và bảo quản mẫu
- đối với ký sinh trùng ựơn bào cố ựịnh mẫu bằng cách phết kắnh: Dùng lamen ựặt lên trên lam kắnh ở vị trắ có mẫu, phết nhanh ựể khô tự nhiên và nhuộm tiêu bản bằng bạc nitrat.
- đối với trùng hai tế bào Gregarine: Tốt nhất ta nên soi ngay khi tôm còn sống, những con chưa kiểm tra ựược ngay nên bảo quản trong dung dịch Davidsion. Cũng có thể bảo quản tôm trong tủ lạnh vì qua thử nghiệm cho thấy trùng hai tế bào bảo quản ựược một thời gian trong tủ lạnh. Tách trùng hai tế bào riêng rẽ từng con một và tiến hành nhuộm màu bằng Hematoxyline. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 25
nhuộm khác nhau.
- để kiểm tra sự có mặt của vi bào tử trong gan tụy của tôm, tiến hành cố ựịnh mẫu tôm bằng dung dịch Davidson. Ấu trùng và tôm giống có thể ựể nguyên cả con trong lọ. Tôm lớn dùng xilanh tiêm trực tiếp dung dịch cố ựịnh vào vùng mô làm mẫu từ 0,1 - 10 ml tuỳ theo trọng lượng của tôm (thường lượng thuốc cố ựịnh bằng 5 - 15 % trọng lượng của tôm). Tỷ lệ thuốc cố ựịnh và mẫu là 10 : 1. Ngâm mẫu cố ựịnh từ 24 - 72 giờ tuỳ theo kắch cỡ của tôm. Sau ựó mẫu tôm ựược giữ trong dung dịch cồn 70%.
* Nhuộm màu và làm tiêu bản
- Mẫu là các loài ký sinh trùng ựơn bào dùng Nitrat bạc (AgNO3) 2% ựể nhuộm (phương pháp của Krenh). Lấy lam có trùng xếp một lượt vào chậu thủy tinh (ựể mặt có trùng lên trên), dùng pipet nhỏ 2-3 giọt dung dịch AgNO3 2% lên lam (nhỏ ựều khắp mặt lam). Sau ựó ựể tất cả chậu thủy tinh trong bóng tối 10 phút. Lấy mẫu ra rửa bằng nước sạch nhiều lần. Tất cả các mẫu sau khi rửa ựược chuyển sang chậu thủy tinh chứa nước cất mới, ngập sâu 1- 1,5 cm, mặt có trùng hướng lên trên, ựem phơi dưới ánh sáng mặt trời trong thời gian từ 30-60 phút tùy theo cường ựộ ánh sáng mặt trời. Trong quá trình nhuộm, phải kiểm tra sự bắt màu của tiêu bản nhuộm. Rửa lại nước cất nhiều lần và ựựng nghiên cho khô. Tiến hành gắn tiêu bản bằng Bom Canada, chú ý tránh ựể có bọt. Cuối cùng chọn tiêu bản ựẹp, lưu lại.
- Mẫu là trùng hai tế bào Gregarine, nhuộm mẫu bằng Hematoxylin: Dùng ống hút nhỏ hút trùng ra, cho lên lam kắnh, dùng cồn 70% cố ựịnh trùng và ựể khô trong không khắ. Sau khi khô cho vào dung dịch Feric Sulphat Amonium 3% trong 12-24 giờ ựể mẫu gắn chặt vào lam kắnh. Rửa nước 2-3 phút. Cho vào thuốc nhuộm Hematoxylin trong 12 giờ ựể bắt mầu. Rửa bằng cách cho qua nước chảy nhẹ. Sau ựó cho lam kắnh có trùng ựã nhuộm vào dung dịch Feric Sulphat Amonium 1,5% ựể phân ly mầu, sự phân ly có thể kéo dài trong vài phút ựến vài giờ. Kiểm tra sự phân ly dưới kắnh hiển vi ựến
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 26
khi nhân bắt mầu nâu ựậm, tế bào chất mầu sáng trong là ựược. Cho vào nước cất 1-2 lần. Làm mất nước bằng cách cho lam kắnh có trùng ựã phân ly mầu lần lượt qua cồn 50%, 70%, 90%, 96% và 100%, mỗi nồng ựộ giữ từ 3-5 phút. Tiếp theo cho mẫu ựã mất nước qua xylen trong khoảng 3-5 phút ựể làm trong. Cho nhựa canada vào lam kắnh có trùng ựã qua xử lý, ựậy lamen lên (ựậy sao cho không có bọt khắ trong tiêu bản). Ghi etyket ựầy ựủ gắn lên lam kắnh. đợi khô cho vào hộp ựựng tiêu bản ựể làm mẫu.
- Mẫu là vi bào tử, nhuộm mẫu bằng thuốc nhuộm Gram hoặc Giemsa. Phết mẫu gan tụy của tôm lên lam kắnh. Nhỏ dung dịch 1: tắm tinh thể (Crystal violet) lên tiêu bản, ựể yên 30-60 giây. Rửa nước nhanh, vẩy khô. Nhỏ dung dịch 2 (Lugol), ựể yên trong 1 phút (tiêu bản có màu ựen). Rửa nước nhanh, vẩy khô. Nhỏ dung dịch 3 (cồn-aceton) từ ựầu lam, nghiêng lam ựể cồn chảy qua chỗ phết mẫu ựể tẩy mầu. Rửa nước nhanh, vẩy khô. Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) ựể yên 1-2 phút. Rửa nước, ựể khô (dùng giấy thấm khô, không ựể xước mẫu). Soi kắnh hiển vi bằng vật kắnh dầu (X100).
Ngoài ra có thể nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa. Mẫu gan tụy ựược phết mỏng lên lam kắnh ựể khô tự nhiên, cố ựịnh bằng cồn Methanol, sau ựó nhuộm Giemsa. Tiến hành soi dưới kắnh hiển vi quang học (X 40, X100).
để kiểm tra sự có mặt của vi bào tử trong các tế bào của gan tụy, tiến hành làm mô tế bào. Các bước ựược thực hiện như sau:
* Chuẩn bị mẫu
+ Sau khi cố ựịnh, mẫu mô sẽ cứng lại. Nếu mẫu lớn phải dùng dao cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 1cm.
+ Cho mẫu vào các lọ ựựng mẫu có ghi nhãn và ựậy nắp lại
* Xử lý mẫu
+ Xử lý mẫu bằng máy xử lý tự ựộng
+ Khử nước ở mẫu bằng dung dịch cồn có nồng ựộ tăng dần + Làm sạch mẫu trong xylen
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 27
+ Cuối cùng thấm parafin cho mẫu sau khi ựã làm sạch
Bảng 3.1. Các bước xử lý mẫu Thứ tự Dung dịch Thời gian 1 Cồn 70% lần I 30 Ờ 60 phút 2 Cồn 80% lần I 30 Ờ 60 phút 3 Cồn 95% lần I 30 Ờ 60 phút 4 Cồn 95% lần II 30 Ờ 60 phút 5 Cồn 95 % lần III 30 Ờ 60 phút 6 Cồn 100% lần I 30 Ờ 60 phút 7 Cồn 100% lần II 30 Ờ 60 phút 8 Xylen 100% lần I 30 Ờ 60 phút 9 Xylen 100% lần II 30 Ờ 60 phút 10 Parafin lần I 90 phút 11 Parafin lần II 120 phút * đúc Parafin
+ đặt mẫu ựã thấm Parafin vào khuôn ựổ parafin và giữ mẫu ở giữa khuôn. Làm lạnh mẫu trên bàn lạnh hoặc ựể trong tủ lạnh.
+ Cắt gọt khối parafin có mẫu: Dùng dao cắt gọt bỏ những parafin thừa và mặt của khối có mẫu cắt sâu vào 3 Ờ 5 mm.
* Cắt mẫu
+ Gắn khối Parafin vào máy cắt mô (Microtom) Cắt mẫu: Những lát cắt dày khoảng 5 Ờ 7ộm
Chọn mẫu cắt: ựặt các lát cắt vào nước ấm, chờ cho mẫu phẳng rồi lấy lam kắnh hớt nhẹ cho mẫu nằm ở giữa lam.
+ Sau ựó ựể lam vào máy sấy ở nhiệt ựộ 450C cho mẫu khô rồi ựem nhuộm màu.
* Nhuộm màu: nhuộm tiêu bản theo hai phương pháp:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 28
+ Loại parafin bằng xylen và rửa nước: cho khay ựựng mẫu vào lần lượt qua xylen I, xylen II, mỗi dung dịch 5 phút. Sau ựó cho qua lọ cồn 100% (I), cồn 100% (II), cồn 95%, cồn 70% (mỗi nồng ựộ 2 phút). Sau ựó cho vào nước nhúng khoảng 10 lần, thấm giấy rồi cho vào hematoxylin.
+ Nhuộm Hematoxylin theo Mayer: 2 - 5 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Rửa nước cho ựến khi có màu xanh nhạt nhuộm Eosin + Nhuộm Eosin 5 - 10 phút
+ Làm mất nước: cho vào cồn 75%, cồn 95%, cồn 100%(I), cồn 100% (II) mỗi nồng ựộ 2 phút
+ Làm trong mẫu: cho vào xylen I, xylen II mỗi xylen 2 phút
+ Gắn lamen lên mẫu ựã nhuộm bằng BomCanada. Tuỳ theo kắch cỡ thước mẫu dùng các lamen tương ứng. Khi ựặt lamen lên lam kắnh từ từ không ựể bọt khắ.
- Phương pháp nhuộm bằng giemsa
+ Loại parafin bằng xylen và rửa nước: cho khay ựựng mẫu vào lần lượt xylen I, xylen II, mỗi dung dịch 5 phút. Sau ựó cho qua lọ cồn 100% (I), cồn 100% (II), cồn 95%, cồn 70% (mỗi nồng ựộ 2 phút). Sau ựó cho vào nước nhúng 10 lần, thấm giấy rồi cho vào dung dịch giemsa.
+ Ngâm mẫu trong dung dịch giemsa ựể qua ựêm.
+ Sau khi nhấc mẫu ra khỏi dung dịch giemsa ta cho mẫu vào nồng ựộ cồn 50%, 70%, 95%, 100%(I), 100% (II), mỗi nồng ựộ 2 phút. Sau ựó cho qua xylen I, xylen II (mỗi xylen 5 phút).
+ Gắn lamen lên mẫu ựã nhuộm bằng Bom Canada. Tuỳ theo kắch cỡ thước mẫu dùng các lamen tương ứng. Khi ựặt lamen lên lam kắnh từ từ không ựể bọt khắ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 29
* đọc kết quả
- đối với nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin (H&E)
+ đọc kết quả dưới kắnh hiển vi
+ Nhân tế bắt màu xanh tắm, tế bào chất bắt màu hồng, các thể ẩn trong nhân tế bào nhiễm bệnh bắt màu ựỏ ựồng ựều
- đối với nhuộm bằng giemsa
+ Ký sinh trùng sẽ bắt màu tắm + Nhân sẽ bắt màu xanh
+ Collagen và các mô khác sẽ bắt màu hồng
3.2.7. Phân loại ký sinh trùng
Có thể phân loại ký sinh trùng dựa vào dạng sống hoặc ựã cố ựịnh hoặc ựã làm tiêu bản. Nghiên cứu hình thái cấu tạo của ký sinh trùng, ựo các chỉ tiêu phân loại cần thiết ựối với từng loài khác nhau.
Phương pháp ựo kắch thước ký sinh trùng: Ký sinh trùng nhỏ dùng thước ựo thị kắnh, ký sinh trùng lớn dùng giấy kẻ ly ựể ựo kắch thước. đo tất cả các chỉ tiêu của yêu cầu phân loại ựối với từng loại ký sinh trùng. Số lần ựo tuỳ thuộc vào từng loài ký sinh trùng, số lượng nhiều ựo từ 10 - 15 cá thể. Số lượng ắt ựo toàn bộ cá thể bắt gặp. Ký sinh trùng ựơn bào ựo ắt nhất là 15 cá thể. Ký sinh trùng giun sán ựo ắt nhất là 10 cá thể.
Sử dụng một số tài liệu sau ựể phân loại ký sinh trùng:
- Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam của Hà Ký và Bùi Quang Tề, 2007
- Ký sinh trùng ựơn bào của Lom và Dykova, 1992.
- Apicomplexa Eugregarinorida the genera của Tiến sĩ sinh học