ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1 Nội dung nghiên cứu
3.1.1 Nghiên cứu sự hấp thu và phân bố của Enrofloxacin trong huyết t−ơng dê
Từ hai chế phẩm: Enrotril - 50 của h1ng HANVET (Việt Nam) và Baytril 5% của h1ng BAYER (Đức).
Bằng hai đ−ờng cho thuốc: uống và tiêm bắp; với liều đơn (liều tấn công) và liều lặp lại (liều duy trì).
Từ đó đánh giá chất l−ợng của mỗi chế phẩm; đề xuất liệu trình điều trị thích hợp: vừa đảm bảo hiệu quả điều trị cao, vừa tiết kiệm thuốc, lại thuận tiện cho sử dụng.
3.1.2. Điều trị thử nghiệm trên dê bị viêm ruột ỉa chảy
3.2 Nguyên liệu
3.2.1 Động vật thí nghiệm
Dê cỏ trọng l−ợng từ 30 - 35 kg/con. Dê khoẻ mạnh, tr−ớc khi thí nghiệm 15 ngày không dùng kháng sinh và bất cứ thuốc nào khác.
Với nội dung 3.1.2 chúng tôi sử dụng dê bị viêm ruột ỉa chảy trong tự
nhiên để làm thí nghiệm. Căn cứ vào lịch tiêm phòng vaccine đối với bệnh viêm ruột hoại tử và lịch cho uống thuốc tẩy trừ nội ký sinh trùng cũng nh− thuốc trị ký sinh trùng đ−ờng máu định kỳ đều đặn của Trung tâm nghiên cứu Dê - Thỏ Sơn Tây, chúng tôi loại trừ những dê ỉa chảy do bị viêm ruột hoại tử, nội ký sinh trùng và ký sinh trùng đ−ờng máu.
Thức ăn cho dê thí nghiệm là thức ăn xanh nh−: rau, cỏ, cây bụi. N−ớc là n−ớc máy sạch. N−ớc uống và thức ăn đ−ợc cung cấp tự do theo nhu cầu của dê.
3.2.2 Giống vi khuẩn thí nghiệm
Là giống Bacillus subtilis do viện Thú y quốc gia cung cấp. Dùng canh khuẩn 18 - 24 giờ để làm thí nghiệm.
3.2.3 Thuốc kháng sinh
Enrotril - 50 có hàm l−ợng Enrofloxacin trong chế phẩm là 5% do Công ty thuốc thú y HANVET sản xuất và cung cấp.
Baytril 5% có hàm l−ợng Enrofloxacin trong chế phẩm là 5% do Công ty BAYER sản xuất và cung cấp.
3.2.4 Các môi tr−ờng nuôi cấy vi khuẩn (Nguyễn Nh− Thanh, 1974 [20]). Môi tr−ờng n−ớc thịt pepton
+ N−ớc thịt : 1000 ml
+ Pepton : 5 g
+ Muối tinh (NaCl) : 9 g
+ pH sau khi tiệt trùng : 7,2 - 7,4
Môi tr−ờng thạch tráng (thạch n−ớc thịt pepton)
+ N−ớc thịt pepton : 1000 ml
+ Thạch (agar) : 12,5 g
+ pH sau khi tiệt trùng : 7,2 - 7,4
Môi tr−ờng thạch nền
+ N−ớc cất : 1000 ml
+ Thạch (agar) : 22 g
+ Muối tinh (NaCl) : 9 g
+ pH sau khi tiệt trùng : 7,2 - 7,4
3.2.5 Dụng cụ thí nghiệm
Hộp lồng peptri loại trong suốt, đáy bằng phẳng, có đ−ờng kính 100 mm, cao 15 mm; ống ly tâm bằng thuỷ tinh; cốc đong có chia độ loại 100 ml; ống trụ bằng nhôm cao 10 mm (đ−ờng kính trong 8mm, đ−ờng kính ngoài 9mm); bơm tiêm (Seringe) loại 1 ml và 5 ml; que cấy vi khuẩn
và các dụng cụ khác. Nồi hấp cao áp, tủ sấy tiệt trùng và buồng cấy ERHET, máy ly tâm, tủ ấm. Nhiệt kế thuỷ ngân, ống nghe.
3.2.6 Hoá chất
Dung dịch NaOH 0,1N và HCl 0,1N dùng để điều chỉnh pH của môi tr−ờng nuôi cấy vi khuẩn; dung dịch Citrat Natri 5% dùng chống đông máu, n−ớc cất, bông, cồn sát trùng 70%.
3.3 Địa điểm nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu đ−ợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Nội
- Chẩn - D−ợc - Độc chất Khoa Thú y, Tr−ờng Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. Bệnh viện Thú y, Tr−ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Điều trị thử nghiệm tại Trung tâm nghiên cứu Dê - Thỏ Sơn Tây.
3.4 Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Nghiên cứu sự hấp thu và phân bố thuốc Enrofloxacin theo ph−ơng
pháp Vi sinh vật ghi trong D−ợc điển Việt Nam II (Tr−ơng Công Quyền và
cộng sự 1994 [19]).
3.4.1.1 Bố trí thí nghiệm
Dê thí nghiệm đ−ợc nuôi trong điều kiện nh− nhau, n−ớc uống và thức ăn hàng ngày đ−ợc cung cấp tự do.
Thí nghiệm đ−ợc bố trí theo ph−ơng pháp phân lô so sánh.
Tất cả dê ở các thí nghiệm d−ới đây, tr−ớc khi cho thuốc đều đ−ợc lấy máu, chắt huyết t−ơng để kiểm tra vòng vô khuẩn (coi là đối chứng so sánh với mẫu huyết t−ơng của chính bản thân chúng sau khi đ1 tiêm hoặc uống thuốc).
Chúng tôi tiến hành cho uống hoặc tiêm thuốc Enrofloxacin cho dê trong các lô theo sơ đồ bố trí thí nghiệm sau:
Các lô thí nghiệm Số dê thí nghiệm (con)
Lô 1 : uống, liều 7,5 mg/kgTT. 2
Lô 2 : Tiêm bắp, liều 7,5 mg/kgTT 2
Lô 3 : Tiêm bắp, liều lặp, phác đồ 1 (tiêm lần 1: liều
7,5 mg/kgTT, tiêm lần 2: liều 7,5 mg/kgTT). 2
Lô 4 : Tiêm bắp, liều lặp, phác đồ 2 (tiêm lần 1: liều
7,5 mg/kgTT, tiêm lần 2: liều 5 mg/kgTT). 2
Sơ đồ 1:Các thí nghiệm dùng chế phẩm Enrotril - 50
Các lô thí nghiệm Số dê thí nghiệm
(con)
Lô 5 : uống, liều 7,5 mg/kgTT. 2
Lô 6 : tiêm bắp, liều 7,5 mg/kgTT.
2
Lô 7 : Tiêm bắp, liều lặp phác đồ 1 (tiêm lần 1: liều
7,5 mg/kgTT, tiêm lần 2: liều 7,5 mg/kgTT). 2
Lô 8 : Tiêm bắp, liều lặp phác đồ 2 (tiêm lần 1: liều
7,5 mg/kgTT, tiêm lần 2: liều 5 mg/kgTT). 2
Sơ đồ 2:Các thí nghiệm dùng chế phẩm Baytril 5%
Sau đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu sự hấp thu và phân bố của thuốc Enrofloxacin trong huyết t−ơng dê theo trình tự các b−ớc sau:
+ B−ớc I:
Sau khi cho uống hoặc tiêm thuốc: 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Mỗi thời điểm lấy 1ml máu/con (ở tĩnh mạch cổ) cho vào ống ly tâm có sẵn Citrat Natri khan, xoay nhẹ cho tan, đậy nút, đánh dấu máu của từng con, sau đó mang ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó chắt huyết t−ơng làm kháng sinh đồ theo ph−ơng pháp đặt ống trụ (ph−ơng pháp của Heastley).
ảnh 3.1: Lấy máu tĩnh mạch cổ dê
+ B−ớc II:
Thạch nền đ−ợc hấp −ớt ở 121 0C/20 phút, để nguội đến khoảng 50 oC,
rồi đổ vào mỗi hộp lồng (đ1 đ−ợc rửa sạch, vô trùng) 8 - 10 ml, láng cho thạch dàn đều trên đáy hộp lồng. Để yên tĩnh trên mặt phẳng nằm ngang từ 5 - 10 phút để thạch đông đặc lại.
Thạch tráng sau khi hấp −ớt ở 121 0C/20 phút, để nguội đến khi nhiệt độ
của thạch tráng xuống đến 45 - 50 0C thì cho canh khuẩn Bacillus subtilis đ1
nuôi cấy 18 - 24 giờ vào (tỉ lệ 0,2 ml canh khuẩn/100 ml thạch) lắc trộn đều rồi dùng pipet hút và đổ vào mỗi hộp lồng (đ1 có thạch nền chuẩn bị ở phần trên) 10 ml. Láng cho thạch dàn đều trên mặt thạch nền, để yên tĩnh trên mặt
phẳng nằm ngang khoảng 5 - 10 phút cho đến khi đông hẳn. Đặt vào mỗi hộp lồng 4 ống trụ đ1 đ−ợc vô trùng, khi đặt ống trụ phải chú ý các yêu cầu sau:
+ Thao tác phải dứt khoát, chỉ đặt mỗi ống một lần, khi đ1 cắm vào thạch rồi thì tuyệt đối không điều chỉnh lại nữa.
+ ống trụ phải vuông góc với mặt thạch tráng.
+ ống trụ chỉ vừa vặn qua hết lớp thạch tráng, vừa chạm mặt
thạch nền thì dừng lại.
+ Bốn ống trụ phải cách đều nhau và cách đều thành hộp lồng.
+ B−ớc III:
Hút chính xác từ mỗi mẫu 0,4 ml huyết t−ơng đ−ợc chuẩn bị từ b−ớc I, cho vào mỗi ống trụ (trong hộp lồng đ−ợc chuẩn bị từ b−ớc hai) 0,2 ml. Cứ một mẫu thì cho vào hai ống trụ đối xứng nhau. Đánh dấu các mẫu t−ơng ứng
với ống trụ. Để yên tĩnh trong tủ ấm 37 oC/18 - 24 giờ thì bỏ ra, dùng th−ớc đo
mm đo đ−ờng kính vòng vô khuẩn nếu có. Các b−ớc II và III phải tiến hành trong tủ cấy ERHET.
ảnh 3.2: Thao tác cấy chuyển tiến hành trong tủ cấy ERHET
3.4.2.2 Tiến hành xây dựng đ−ờng kháng sinh chuẩn để tính kết quả
Dùng kháng sinh Enrofloxacin dạng chuẩn, pha với n−ớc sinh lý thành
kháng sinh đồ nh− ở phần trên. Đo đ−ờng kính vòng vô khuẩn của d1y hàm l−ợng thuốc chuẩn này, ta sẽ thiết lập đ−ợc một đ−ờng t−ơng quan chuẩn giữa đ−ờng kính vòng vô khuẩn với hàm l−ợng thuốc. Đối chiếu đ−ờng kính vòng vô khuẩn của các mẫu với đ−ờng t−ơng quan chuẩn này ta sẽ tính đ−ợc số
microgram (àg) thuốc có trong 1ml huyết t−ơng.
3.4.2 Điều trị thử nghiệm cho dê bị viêm ruột ỉa chảy bằng ph−ơng pháp tiêm bắp
3.4.3 Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu thu đ−ợc, đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp thống kê sinh học với các công thức nh− sau:
- Số trung bình : X = n Xi n i ∑ =1 - Độ lệch chuẩn : 1 ) ( 2 − − = ∑ n X Xi δ Với n < 30 - Sai số trung bình : mx = ± 1 − n S Với n < 30
Trong đó: Xi : giá trị của mẫu quan sát
X : số trung bình