3. ðỐ IT ƯỢNG, ðỊ Að IỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN
3.5.1. Cỏc thớ nghiệm và phương phỏp thực hiệ n
Cỏc thớ nghiệm thực hiện theo cỏc phương phỏp thường ỏp dụng trong nghiờn cứu của Viện Bảo vệ thực vật [22, 23] và tiờu chuẩn ngành [19]
3.5.1.1. Thớ nghiệm 1: ðiều tra thu thập và phõn tớch hàm lượng saponin trong thảo mộc.
Tiến hành ủiều tra, thu thập mẫu vật tại 1 số cơ sở ộp dầu trẩu, dầu sở, thanh hao hoa vàng, v.v. Tại mỗi nơi tiến hành thu nhận cỏc thụng tin như: mựa vụ thu hoạch, cỏch sử lý bảo quản phụ phẩm (bó), số lượng hàng năm,
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...24 giỏ cả, v.v. Sau ủú, mỗi loại lấy 10 kg ủem về phũng thớ nghiệm ủể phõn tớch và làm cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
Việc phõn tớch ủịnh lượng hàm lượng hoạt chất Saponin trong cỏc loại thảo dược ủược tiến hành như sau: Chiết trực tiếp bằng dụng cụ chuyên dụng chuẩn Shoxlet mẫu cần phân tích với dung môi MeOH 20% n−ớc sau đó chiết lần l−ợt bằng các dung môi n-hexan, CHCl3, EtOAc và butanol. Dịch chiết nhận đ−ợc sẽ đ−ợc làm khan, loại chất làm khan bằng cất quay chân không d−ới áp suất giảm, thu đ−ợc các cặn n-hexan, CHCl3, EtOAc và butanol (cặn BuOH chính là saponin tổng số).
3.5.1.2. Thớ nghiệm 2: ðỏnh giỏ hoạt lực gõy chết ủối với tuyến trựng nốt sưng (Meloidogyne incognita) của một số thảo dược trong phũng thớ nghiệm.
Thu thập nguồn tuyến trựng u sưng Meloidogyne sp hại rễ bớ, cà chua ngoài ủồng ruộng, tiến hành rửa sạch và cắt nhỏ, cho vào gốc cà chua giống sạch bệnh (ủược trồng trờn ủất ủó ủược khử trựng) ủể nhõn nguồn tuyến trựng phục vụ cho cỏc thớ nghiệm của ủề tài.
Phương phỏp tỏch lọc và ủếm tuyến trựng ủược tiến hành theo phương phỏp xay-lọc của Speijer và De Waele (1997). Tỏch tuyến trựng trong ủất theo phương phỏp của Baermann cú cải tiến (1963).
Thí nghiệm ủược bố trí trong phũng thớ nghiệm với 7 công thức liều lượng thảo dược khỏc nhau. Cụ thể:
Cụng thức 1: 100 % dịch chiết bó sở Cụng thức 2: 70% dịch chiết bó sở Cụng thức 3: 50% dịch chiết bó sở Cụng thức 4: 100 % dịch chiết bó trẩu Cụng thức 5: 70% dịch chiết bó trẩu Cụng thức 6: 50% dịch chiết bó trẩu
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...25 Cụng thức 7: ðối chứng (khụng xử lý)
Mỗi cụng thức bố trớ 5 lần nhắc lại là 5 hộp petri. Cỏch tiến hành thớ nghiệm cụ thể như sau:
- Cỏch pha: Cõn mỗi loại thảo mộc 200g, ngõm riờng trong 1 lớt nước và ủể trong 12 giờ. Sau ủú, dựng rõy lọc lấy dịch chiết ủể làm thớ nghiệm.
- Cỏch tiến hành thớ nghiệm và theo dừi: cho vào mỗi ủĩa petri 13ml dung dịch chiết thảo mộc ủó pha với nước cất theo tỷ lệ tương ứng với cỏc cụng thức thớ nghiệm, cựng với 2 ml nước cú chứa 480 cỏ thểtuyến trựng tuổi 2 và ủể ở ủiều kiện nhiệt ủộ phũng thớ nghiệm. Sau 3 giờ, 18 giờ, 2 ngày, 4 ngày, 7 ngày và 18 ngày tiến hành ủếm số lượng tuyến trựng sống, chết ở trong ủĩa petri của cỏc cụng thức. Từ ủú, tớnh hiệu quả gõy chết tuyến trựng ở cỏc cụng thức sử dụng với nồng ủộ dịch chiết thảo mộc khỏc nhau.
Tớnh toỏn hiệu quả gõy chết tuyến trựng của thảo mộc trong phũng thớ nghiệm ủược tớnh bằng cụng thức Abbott.
C - T H(%) = --- x 100
C
Trong ủú: C là số tuyến trựng sống ở cụng thức ủối chứng. T là số tuyến trựng sống ở cụng thức thớ nghiệm
3.5.1.3. Thớ nghiệm 3 ðỏnh giỏ hiệu lực hạn chế tuyến trựng nốt sưng (Meloidogyne incognita) trờn cà chua của một số thảo mộc trong ủiều kiện nhà lưới.
Thớ nghiệm ủược bố trớ trong nhà lưới với 7 cụng thức. Mỗi cụng thức 5 lần nhắc lại (5 chậu). Mỗi chậu trồng 3 cõy. Giống cà chua 375.
Cụ thể cỏc cụng thức thớ nghiệm như sau:
CT 1: Bó sở 30 g/chậu CT 4: Bó trẩu 30 g/chậu CT 2: Bó sở 40 g/chậu CT 5: Bó trẩu 40 g/chậu CT 3: Bó sở 50 g/chậu CT 6: Bó trẩu 50 g/chậu
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...26 CT 7: ðối chứng (khụng xử lý)
+ Cỏch tiến hành thớ nghiệm
Thớ nghiệm ủược tiến hành theo 3 bước, gồm: chuẩn bị ủất thớ nghiệm, trồng cõy thớ nghiệm (cà chua) và lõy nhiễm loại tuyến trựng ủó ủược chuẩn bị sẵn trong phũng thớ nghiệm. Cụ thể như sau:
Bước 1. Chuẩn bị ủất: ðất trồng ủược trộn theo tỷ lệ 80% ủất và 20% mựn hữu cơ. Sau ủú, ủem hấp khử trựng ở ủiều kiện 1210C trong 40 phỳt. Sử dụng loại chậu cao su ủược rửa sạch, phơi khụ trước khi làm thớ nghiệm.
Bước 2. Trồng cà chua: Chậu ủược lút một lớp nilon. Sử dụng cõy giống cà chua sạch bệnh, ủó ủược kiểm tra khụng cú tuyến trựng trong ủất và rễ, sinh trưởng và phỏt triển tốt.
Cõn 2,3 kg ủất ủó khử trựng cho mỗi chậu, trộn ủều với chế phẩm hoặc mựn hữu cơ ủó khử trựng (tuỳ theo từng cụng thức). ðổ 2/3 khối lượng ủất vào chậu, chọn cõy giống ủều nhau và trồng 3 cõy vào mỗi chậu. Sau ủú, ủổ nốt 1/3 số ủất cũn lại vào chậu, rồi tưới nhẹ xung quanh gốc. Sau 1 tuần cõy sinh trưởng ổn ủịnh, chọc 3 lỗ ủỏy ủể thoỏt nước. Chậu luụn ủược ủặt lờn trờn ủĩa nhựa ủể giữ tuyến trựng. Hàng ngày tiến hành chăm súc, vệ sinh và tưới ủủẩm cho cõy phỏt triển.
Thu thập nguồn tuyến trựng u sưng Meloidogyne sp. hại rễ bớ, cà chua ngoài ủồng ruộng, tiến hành rửa sạch và cắt nhỏ, cho vào gốc cà chua giống sạch bệnh (ủược trồng trờn ủất ủó ủược khử trựng) ủể nhõn nguồn tuyến trựng phục vụ cho cỏc thớ nghiệm của ủề tài.
Bước 3. Nhiễm tuyến trựng: Thu thập nguồn rễ cõy cà chua bị tuyến trựng u sưng ngoài ủồng. ðem về phũng thớ nghiệm, cắt lấy phần rễ cõy bị nhiễm tuyến trựng ủem xay, lọc và thu tuyến trựng ủể làm thớ nghiệm.
Khi cà chua trong cỏc chậu ủó bộn rễ, khoảng 10 ngày sau khi trồng thỡ tiến hành lõy nhiễm tuyến trựng vào chậu ủất trồng cà chua với liều lượng
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...27 khoảng 2.500 con/ chậu. Bằng cỏch lấy chiếc ủũa nhỏ, chọc 3 lỗ nhỏ sõu 5 – 7 cm cạnh rễ cà chua và khoỏy nhẹ chỗ lỗ to ra. ðổ dung dịch tuyến trựng vào lỗ, sau ủú lấp ủất lại. Việc lõy nhiễm tuyến trựng phải ủược thực hiện vào lỳc chiều mỏt. Tất cả cỏc chậu thớ nghiệm ủược ủặt trờn ủĩa ủể trỏnh tuyến trựng di chuyển ra ngoài khi tưới nước, trờn cú mỏi che mưa.
+ Cỏch theo dừi
ðịnh kỳ mỗi thỏng 1 lần tiến hành lấy mẫu phõn tớch. Mỗi ủợt theo dừi lấy 3 cõy, cắt lấy toàn bộ rễ cõy. Cỏc mẫu rễ thu ủược gúi bằng giấy bản và gúi riờng rẽ, ủem về phũng thớ nghiệm rửa sạch ủất. Sau ủú, ủếm và ghi chộp lại số nốt sưng trờn mỗi bộ rễ của cõy. Sau khi ủếm xong, thỡ cắt bộ rễ từng cõy và thỏi nhỏ thành ủoạn 0,5cm và cho vào rổ nhựa cú ủường kớnh 15cm, bờn trong rổ nhựa ủặt một mảnh giấy lọc. ðặt lờn một ủĩa trũng lũng vừa với kớch thước rổ lọc, cho nước sạch vào và giữ mực nước xấp xỉ bề mặt rễ trong rổ nhựa. Tuyến trựng sẽ di chuyển ra ngoài nước qua giấy lọc xuống ủĩa. Sau 48 giờ, thỡ bỏ rổ nhựa ra và lấy mẫu nước ủể ủếm số tuyến trựng cú trong nước ở mỗi ủĩa.
+ Chỉ tiờu theo dừi
ðịnh kỳ sau 1, 2, 3 thỏng theo dừi cỏc chỉ tiờu sau: - Số nốt sưng do tuyến trựng trờn bộ rễ
- Mật ủộ tuyến trựng cú trong 5 gam rễ (con/5g rễ cõy). - Số lượng tuyến trựng cú trong 100 gam ủất (con/100g ủất) - Tỡnh trạng sinh trưởng của cõy và sự phỏt triển của bộ rễ
Tớnh toỏn hiệu lực trừ sõu của cỏc cụng thức thớ nghiệm về cỏc loại chế phẩm thảo dược theo cụng thức Henderson - Tilton.
3.5.1.4. Thớ nghiệm 4: ðỏnh giỏ khả năng sinh trưởng phỏt triển của nấm ủối khỏng Trichoderma viride trong mụi trường thảo mộc.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...28 Thớ nghiệm ủược tiến hành với 3 loại thảo mộc (TM). Thớ nghiệm với 4 cụng thức và mỗi cụng thức nhắc lại 15 lần. Cụ thể:
CT 1: Mụi trường Czapek cú chứa 3,0% dịch chiết TM1. CT 2: Mụi trường Czapek cú chứa 3,0% dịch chiết TM2 CT 3: Mụi trường Czapek cú chứa 3,0% dịch chiết TM3 CT 4: Mụi trường Czapek cú chứa 3,0% nước cất (ủối chứng)
Mụi trường Czapek-Dox bao gồm:
- Sacharoza: 30g - MgSO4: 0,5g - KCl: 0.5g - NaNO3: 3g - FeS04: 0.1g - K2HPO4: 1g
Thớ nghiệm ủược tiến hành với loại thảo mộc (TM2) là bó trẩu. Thớ nghiệm với 4 cụng thức (CT) và mỗi cụng thức nhắc lại 15 lần. Cụ thể:
Khử trựng mụi trường ở nhiệt ủộ 121o C trong 30 phỳt. Sau ủú, phõn bổ vào cỏc ủĩa Petri. Cấy nấm theo phương phỏp cấy ủiểm.
- Chỉ tiờu theo dừi: sau 2, 3, 5,7 và 10 ngày sau khi cấy nấm thỡ tiến hành theo dừi sự phỏt triển của nấm bằng cỏch ủo ủường kớnh khuẩn lạc
3.5.1.5. Thớ nghiệm 5. ðỏnh giỏ hiệu quả hạn chế tuyến trựng bệnh nốt sưng hại rễ Meloidogyne sp. của cỏc hỗn hợp phối trộn nấm ủối khỏng và thảo mộc trong ủiều kiện nhà lưới.
Bố trớ thớ nghiệm với 4 cụng thức tương ứng với cỏc tỷ lệ liều lượng phối trộn giữa nấm ủối khỏng và thảo mộc ủó ủược lựa chọn từ thớ nghiệm 4. Cụ thể như sau: Cụng thức 1: 10% nấm ủối khỏng và 90% thảo mộc Cụng thức 2: 5% nấm ủối khỏng và 95% thảo mộc Cụng thức 3: 2% nấm ủối khỏng và 98% thảo mộc Cụng thức 4: Khụng sử dụng chế phẩm (ðối chứng 1)
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...29 + Cỏch tiến hành:
Thớ nghiệm ủược tiến hành theo cỏc bước như sau:
Bước 1: Chuẩn bị thớ nghiệm: ðất phự sa ủược phơi khụ nỏ sau ủú ủập nhỏ trộn với hỗn hợp hữu cơ theo tỷ lệ: 85% ủất + 15 % hỗn hợp hữu cơ. Hấp trong ủiều kiện 1210C trong 30 phỳt. Cõn 2 kg ủất ủó hấp vào 1 chậu (cho nilon vào ủỏy chậu nhựa). Mỗi cụng thức 5 lần nhắc lại. Cõn 18g hỗn hợp phối trộn của cỏc cụng thức trộn ủều vào ủất của cỏc chậu thuộc cỏc lần nhắc của mỗi cụng thức thớ nghiệm. Mỗi lần nhắc lại là 1 chậu trồng 3 cõy cà chua.
Bước 2: Nhiễm tuyến trựng: Cà chua sau gieo lờn ủược 10cm (vào khoảng 2 tuần) thỡ tiến hành trồng vào chậu. Chờ cà chua hồi xanh (khoảng 10 ngày) tiến hành nhiễm tuyến trựng vào chậu ủất trồng cà chua. Lấy ủũa nhỏ, chọc 3 lỗ nhỏ sõu 5- 7 cm cạnh rễ cà chua và khoỏy nhẹ cho lỗ to ra. ðổ dung dịch tuyến trựng vào lỗ, sau ủú lấp ủất luụn. Nhiễm vào lỳc trời mỏt. Nhiễm 3000 – 5000 tuyến trựng tổng số/ 1 chậu. Hàng ngày, tiến hành chăm súc và kiểm tra thớ nghiệm.
- Chỉ tiờu theo dừi: Sau 1 thỏng, 2 thỏng tiến hành ủỏnh giỏ hiệu lực trừ tuyến trựng của cỏc cụng thức thớ nghiệm với cỏc chỉ tiờu sau ủõy:
+ Sau 1 thỏng: Tỷ lệ (%) rễ bị bệnh nốt sưng; khối lượng rễ (g); số lượng tuyến trựng/ rễ cõy (con).
+ Sau 2 thỏng: Tỷ lệ (%) rễ bị bệnh nốt sưng; khối lượng rễ (g); số lượng tuyến trựng/ rễ cõy (con).
3.5.1.6. Thớ nghiệm 6: ðỏnh giỏ hiệu quả hạn chế tuyến trựng và bệnh hộo vàng Fusarium oxysporum và bệnh hộo rũ gốc mốc trắng Sclerotium rolfsii hại rễ cà chua của cỏc hỗn hợp nấm ủối khỏng và thảo mộc.
Bố trớ thớ nghiệm trong nhà lưới với 5 cụng thức, tương ứng với cỏc tỷ lệ liều lượng phối trộn giữa nấm ủối khỏng và thảo mộc ủó ủược lựa chọn từ thớ nghiệm 2. Cụ thể như sau:
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...30 Cụng thức 1: 2% nấm ủối khỏng và 98% thảo mộc Cụng thức 2: 5% nấm ủối khỏng và 95% thảo mộc Cụng thức 3: 10% nấm ủối khỏng và 90% thảo mộc Cụng thức 4: Khụng sử dụng chế phẩm (ðối chứng 1) Cụng thức 5: Dựng thuốc hoỏ học trừ bệnh (ðối chứng 2) Cỏch thực hiện như sau:
Bước 1: Chuẩn bị thớ nghiệm: ðất phự sa ủược phơi khụ nỏ, sau ủú ủập nhỏ trộn với hỗn hợp hữu cơ theo tỷ lệ: 85% ủất + 15 % hỗn hợp hữu cơ. Hấp trong ủiều kiện 1210C trong 30 phỳt.
Cõn 2 kg ủất ủó hấp vào khay nhựa kớch thước 40 x 60 x 5(cm) cú lút nilon vào ủỏy khay. Mỗi cụng thức 5 lần nhắc lại (5 khay). Cõn 20 gam hỗn hợp chế phẩm của cỏc cụng thức, rồi trộn ủều vào ủất của cỏc khay thuộc cỏc lần nhắc của mỗi cụng thức thớ nghiệm. Mỗi lần nhắc lại là 1 khay và mỗi khay gieo 2 gam hạt cà chua.
Chuẩn bị nấm bệnh: Nguồn bệnh đ−ợc nhân sinh khối từ nguồn nấm l−u trữ tại bộ môn Bệnh cây (Viện Bảo vệ thực vật) trên môi tr−ờng Czapek trước khi tiến hành thớ nghiệm 7- 10 ngày.
Bước 2: Nhiễm bệnh: Cà chua sau gieo cú lỏ thật (vào khoảng 1 tuần) thỡ tiến hành nhiễm bào tử nấm bệnh. Trước khi thớ nghiệm, kiểm tra hàm lượng bảo tử trong dung dịch và nhiễm mỗi khay 20ml dịch bào tử bằng cỏch hũa loóng với 180 ml nước cất (ủể cú tổng số 200ml) rồi tưới ủều vào khay cà chua ủú mọc. Hàng ngày theo dừi, chăm súc thớ nghiệm.
- Chỉ tiờu theo dừi: Sau 10, 20, 30 ngày tiến hành theo dừi ở cỏc cụng thức trong thớ nghiệm với cỏc chỉ tiờu:
+ Tỷ lệ % cõy bị bệnh
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ...31 3.5.1.7. Thớ nghiệm 7: Xỏc ủịnh liều lượng sử dụng chế phẩm thớch hợp ngoài ủồng ruộng - Trờn cà chua: Thớ nghiệm tiến hành trờn cà chua tại HTX Võn Nội (Hà Nội) với 5 cụng thức, nhắc lại 3 lần. Mỗi ụ thớ nghiệm (lần nhắc lại) tiến hành trờn diện tớch 20 m2. Cỏc biện phỏp khỏc, như: bún phõn, tưới nước, vun xới ủất, v.v. ủược tiến hành bỡnh thường như ruộng nụng dõn. Liều lượng sử dụng chế phẩm ở cỏc cụng thức thớ nghiệm như sau:
Cụng thức 1: Liều lượng sử dụng 300 kg/ha Cụng thức 2: Liều lượng sử dụng 500 kg/ha Cụng thức 3: Liều lượng sử dụng 700 kg/ha
Cụng thức 4: Khụng dựng chế phẩm và thuốc húa học (ủối chứng 1) Cụng thức 5: Cú sử dụng thuốc húa học trừ bệnh hộo vàng Fusarium
oxysporum, bệnh hộo rũ gốc mốc trắng Sclerotium rolfsii và tuyến trựng với liều lượng theo khuyến cỏo.
Theo dừi thớ nghiệm: vào cỏc thời ủiểm 20 ngày, 40 ngày, 60 ngày, 80 ngày sau khi trồng cà chua tiến hành lẫy mẫu 5 cõy ngẫu nhiờn trong mỗi ụ thớ nghiệm và theo dừi cỏc chỉ tiờu sau:
+ Tỷ lệ cõy bị bệnh sương mai và cỏc bệnh hại rễ khỏc + Mức ủộ hại theo chỉ số bệnh
+ Tỷ lệ cõy cú nốt u sưng do tuyến trựng + Số lượng tuyến trựng trong 50 gam rễ + Số lượng tuyến trựng trong 100 gam ủất - Trờn hồ tiờu
Thớ nghiệm tiến hành tại xó Nõm NJang (ðắk Song, ðắk Nụng) ủược bố trớ với 4 cụng thức như sau: