hoặc giải ựông
Khi ựông lạnh hoặc giải ựông, các hiện tượng nêu trên sẽ ựe doạ sự sống của tinh trùng, nhưng khi có biện pháp chống ựông thì khả năng tồn tại của tinh trùng là thực tế. Các nhân tố sau ựây giúp tinh trùng tồn tại khi ựông lạnh hoặc giải ựông (Ditto, 1992) [45].
2.1.5.1. Sức ựề kháng của tinh trùng ựối với ựông lạnh
Khả năng của tinh trùng chịu ựựng ựược ựông lạnh gọi là sức kháng ựông và thường ựược ựo bằng tỷ lệ hồi phục lại của tinh trùng sau khi ựông lạnh và giải ựông. Ở bò ựực, sức kháng ựông của tinh trùng là khác nhau, tùy theo từng cá thể bò ựực, ựiều kiện lúc lấy tinh và tuổi của bò ựực. Cụ thể như sau:
a. Giống, cá thể và tuổi
Sự khác nhau về sức kháng ựông của tinh trùng thể hiện rõ giữa các cá thể bò ựực, nhưng không rõ ràng giữa các giống mặc dù chúng ta có thể thấy
sự khác nhau này. Giống có một yếu tố cận huyết cao thì có thể thể hiện sức kháng ựông của tinh trùng thấp. Tuổi của bò ựực giống cũng ảnh hưởng tới sức kháng ựông. Bò ựực có tuổi 1 - 1,5 năm tuổi, tinh trùng có sức kháng ựông thấp, từ 2 năm tuổi trở lên có sức kháng ựông cao. Nhưng từ 6 năm tuổi trở lên tinh trùng của chúng có sức kháng ựông giảm xuống.
b. Mùa vụ
Vào mùa hè nhiệt ựộ không khắ cao nên sức kháng của tinh trùng vào mùa này thường thấp. Hiện tượng giảm này còn tùy thuộc vào từng cá thể và tuổi của chúng, bò ựực nào già hơn thì dễ bị tác ựộng của nhiệt hơn. Tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng trong mùa hè nóng bức có thể thấp hơn so với tinh trong mùa mát mẻ (Ditto, 1992) [45].
c. Lấy tinh nhiều lần
Khả năng chịu lạnh của tinh trùng biến ựổi theo lần lấy tinh. Lần lấy tinh thứ 2 khả năng chịu lạnh tinh trùng cao hơn khả năng chịu lạnh của lần lấy tinh ựầu (Bidot, 1985) [42].
2.1.5.2. Thành phần của môi trường pha loãng
Thành phần cơ bản của môi trường pha loãng (MTPL) tinh dịch gồm chất có năng lượng ( fructose, lactose, raffinose, glucose, lòng ựỏ trứng gà), chất ựệm ( axit Citric, muối Tris), chất chống ựông (glycerol), chất ựiện giải...
Các loại ựường ựóng vai trò quan trọng trong môi trường, do tác ựộng ựến áp suất thẩm thấu, nó có tác dụng bảo vệ tinh trùng khi ở nhiệt ựộ thấp và là nguồn năng lượng cho tinh trùng.
Chất ựệm có vai trò quan trọng trong duy trì màng sinh chất của tinh trùng khi ựông lạnh và khi giải ựông, trong kắch thắch trao ựổi chất diễn ra bình thường ở tinh trùng sau giải ựông, ựồng thời duy trì sức sống của chúng. Chất ựệm phải tan trong nước với hằng số phân ly ựiện tắch là 6 - 8.
Chất chống ựông - glycerol có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hòa tan mạnh trong nước và cồn, là dung môi tốt cho các chất ựiện giải
và hợp chất hữu cơ, làm giảm khối lượng tinh thể nước (Hiroshi Masuda, 1992) [49].
2.1.5.3. Cân bằng tinh pha ở 50C trước khi ựông lạnh
Bảo quản ở 50C trước khi ựông lạnh sẽ tăng cường sức kháng ựông cho tinh trùng bò ựực. Thông thường tinh bò ựực sau khi khai thác và ựủ tiêu chuẩn pha chế thì tinh dịch sẽ ựược pha loãng lần ựầu ở nhiệt ựộ 35oC, hỗn hợp tinh dịch và môi trường pha loãng này ựược gọi là tinh pha, tinh pha ựược ựưa vào tủ cân bằng làm lạnh dần xuống 50C trong khoảng thời gian từ 2 - 3 giờ. Tinh pha tiếp tục ựược pha lần thứ hai với môi trường có chứa glycerol, lần pha này thực hiện theo phương pháp nhỏ giọt từ từ và cân bằng trong khoảng thời gian từ 2 - 3,5 giờ. Sau ựó tinh pha lần hai ựược nạp vào cọng rạ và tiếp tục cân bằng trong thời gian từ 1 - 2 giờ.
2.1.5.4. Nồng ựộ của glycerol và thời gian cân bằng
Nồng ựộ glycerol trong môi trường pha loãng cuối cùng ựể làm ựông lạnh tinh trùng bò là 6,5 - 7%, nhưng tỷ lệ này có hơi khác nhau tùy theo các thành phần của môi trường pha loãng. Nồng ựộ glycerol trong môi trường pha loãng có mối tương quan ựáng tin cậy với tốc ựộ giải ựông, ựó là nồng ựộ glycerol cao trong môi trường pha loãng là cần thiết cho tốc ựộ giải ựông nhanh (Hiroshi, 1992) [49].
2.1.5.5. Tốc ựộ làm lạnh
Hình 2.10. Ảnh hưởng của glycerol trong dung dịch NaCl so với nồng ựộ NaCl trong dung dịch còn lại khi dung dịch NaCl (0,15M) ựược ựông lạnh
(Hiroshi, 1992) [49]
Tốc ựộ làm lạnh quá nhanh sẽ gây tổn hại tới tinh trùng vì nó gây ra siêu lạnh, thể vẩn và nước lưu giữ trong tế bào. điều ựó gây ra ựông lạnh ngoại bào và sau ựó ựông lạnh nội bào. Tốc ựộ làm lạnh chậm sẽ gây ra tập trung nồng ựộ cho cả dung dịch ngoại bào và dung dịch nội bào và sẽ làm rối loạn tế bào, ựây ựược coi là ảnh hưởng của dung dịch. Tốc ựộ làm lạnh tối ưu là tốc ựộ làm giảm tối ựa cả ựông lạnh nội bào và ảnh hưởng của dung dịch.
Tốc ựộ làm lạnh tối ưu này khác nhau không chỉ theo loại tế bào mà còn theo các yếu tố như các thành phần của thể vẩn tế bào và loại chất chống ựông băng. Chẳng hạn dung dịch ựường saccharide ựược ựông lạnh nhanh (ựông lạnh 2 - 4 phút, 50C xuống - 790C), cho hoạt lực tinh trùng sau giải ựông cao hơn so với ựông lạnh chậm (ựông lạnh 45 phút, từ 50C xuống - 790C), vì ựã ngăn cản ựược ảnh hưởng của dung dịch. Môi trường pha loãng có nồng ựộ glycerol 5-7% ựược ựông lạnh nhanh (ựông lạnh 3 - 5 phút, từ 50C xuống - 1300C) cho hoạt lực tinh trùng cao hơn so với ựông lạnh chậm (ựông lạnh 20 - 40 phút, từ 50C xuống - 790C) (Hiroshi, 1992) [49].
2.1.5.6. Nhiệt ựộ giải ựông
Nhiệt ựộ giải ựông tinh ựông lạnh có ảnh hưởng lớn ựến sức sống, hoạt lực, tỷ lệ acrosome bình thường và quá trình trao ựổi chất bình thường của tinh trùng. Giải ựông tinh cọng rạ bằng nước 350C sức sống tinh trùng cao hơn so với nước 40C họăc 200C. Giải ựông ở nước 35 - 750C cũng cho tỷ lệ acrosome bình thường cao hơn so với nước 40C hoặc 200C. Nhưng nếu giải ựông bằng nước có nhiệt ựộ cao hơn nữa, chẳng hạn nước 900C, sẽ không làm tăng sức sống của tinh trùng.
2.1.5.7. Thời gian bảo quản
Tinh trùng ựông lạnh phải luôn luôn ựược bảo quản ngập chìm trong nitơ lỏng (- 1960C), nếu bảo quản tốt sau vài chục năm, tỷ lệ sống và hoạt lực
tinh của tinh trùng vẫn không thay ựổi, khả năng thụ tinh vẫn không bị giảm (Hà Văn Chiêu, 1997) [9]. Ở Thụy Sỹ tinh ựông lạnh bảo quản 20 năm vẫn thụ tinh và bò mẹ ựẻ bê con ngày 25 - 7 - 1975 (America Breeders Service, 1991) [33]. Ở Nhật Bản tinh cọng rạ bảo quản 4 - 13 năm vẫn có hoạt lực tinh trùng 45 - 55% và có tỷ lệ thụ tinh 54%. Có nhiều trường hợp tinh ựông lạnh bảo quản 20 năm vẫn có tỷ lệ thụ tinh là 69,8% (Hiroshi, 1992) [49].
2.1.6. Môi trường pha loãng tinh dịch bò
Nhờ pha loãng nên ựã phát huy ựược tắnh ưu việt của truyền tinh nhân tạo như tăng khả năng chịu lạnh, tăng hiệu quả sử dụng tinh dịch bò. Môi trường pha loãng cần ựảm bảo những tắnh chất sau ựây:
2.1.6.1. Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu của một chất lỏng phụ thuộc vào nồng ựộ hòa tan của các phân tử và các ion có trong dung dịch ựó. để cho tinh trùng tồn tại ựược, áp suất thẩm thấu của môi trường (áp suất ngoại bào) phải tương ựương như áp suất thẩm thấu bên trong tinh trùng (áp suất nội bào), tức là có hiện tượng ựẳng trương. Các dung dịch ưu trương (áp suất ngoại bào lớn hơn áp suất nội bào) sẽ làm cho tinh trùng teo lại. Các dung dịch nhược trương (áp suất ngoại bào thấp hơn áp suất nội bào) sẽ làm cho tinh trùng trương phồng lên và có thể gây vỡ màng tinh trùng (Nguyễn Tấn Anh, 1984) [1]. Tuy nhiên trong thực tế khả năng chịu ựựng áp suất thẩm thấu của tinh trùng không chặt chẽ mà chúng chịu ựựng và tồn tại ựược trong một khoảng giá trị áp suất thẩm thấu biến thiên nhất ựịnh dao ựộng từ 250 ựến 500 mosmol, nhờ khả năng thắch ứng và ựộ bền thẩm thấu của màng tế bào (Innecda, 1995 trắch từ Hà Văn Chiêu, 1999) [10]. Vì vậy nồng ựộ của các chất tan trong môi trường pha loãng cần tạo nên một áp suất thẩm thấu phù hợp với khả năng chịu ựựng của tinh trùng.
2.1.6.2. pH và năng lực ựệm của môi trường
pH của môi trường phụ thuộc vào nồng ựộ H+ có trong môi trường. Nồng ựộ H+ càng tăng thì môi trường càng toan tắnh và ngược lại. Môi trường pha
loãng tinh dịch phải có pH 6,2 - 6,8 (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc đạt, 1997) [2]. Trong sản xuất ựể môi trường pha loãng tinh dịch có khả năng duy trì một cách ổn ựịnh ựộ pH ở mức thắch hợp, người ta ựưa vào môi trường loại hoá chất có tác dụng làm giảm khả năng kiềm hoá hoặc toan hoá của môi trường.
2.1.6.3. Chất ựiện giải và không ựiện giải trong môi trường
Chất không ựiện giải làm giảm ựộ dẫn ựiện của môi trường giúp tinh trùng tránh ựược mất ựiện tắch, ngăn ngừa hiện tượng tụ dắnh của tinh trùng và tạo ựiều kiện thuận lợi cho tinh trùng duy trì sự sống. Chất không ựiện giải giữ vai trò chất khử, gánh chịu sự tác ựộng của oxy nên có tác dụng như chất chống oxy hoá và bảo vệ chất chống ựông của tinh dịch khỏi bị oxy hoá. Tinh trùng rất mẫn cảm với dung dịch NaCl, nhưng vẫn phải ựưa vào môi trường pha loãng tinh dịch một lượng nhất ựịnh chất ựiện giải không ựộc và có anion hoá trị cao. Nếu tăng cation sẽ làm cho tinh trùng tụ dắnh, khi ựông lạnh tinh trùng sẽ chóng chết, còn các anion tác ựộng lên tinh trùng tốt hơn, vì nó chống ựược hiện tượng tụ dắnh của tinh trùng (Tsuyoshi, 1992) [63].
2.1.6.4. Tác dụng của glycerol
Glycerol là một chất bảo vệ cần thiết, có tác dụng như một chất chống ựóng băng cho tinh trùng (Hiroshi, 1992) [49].
a. Làm thay ựổi ựông lạnh và giải ựông ựối với thể vẩn tế bào
Glycerol có ảnh hưởng ựến thể vẩn tế bào khi ựược ựông lạnh rồi giải ựông. Vắ dụ nếu thể vẩn tinh trùng trong dung dịch Ringer ựược phết mỏng trên phiến kắnh, khi ựược làm lạnh nó bắt ựầu ựông lạnh ở 0 - 80C. Các tinh thể băng có hình gậy dẹt, hình năm cạnh, ở biên ựộ nhiệt ựộ này nó lớn lên nhanh chóng.
Ở nhiệt ựộ khoảng - 200C, tinh trùng bị ựẩy ựi do sự lớn lên của các tinh thể băng và buộc phải vào khoảng trống giữa các tinh thể băng khác. Làm ấm nhanh sẽ làm giảm số lượng tinh thể này và kắch thắch tăng nhanh số bọt khắ và những vết nứt trên tinh thể băng. Khi băng tan tinh trùng nằm ở rìa các
tinh thể. Tinh trùng lơ lửng trong dung dịch Ringer có chứa 15 - 20% glycerol bắt ựầu ựông lạnh ở - 100C ựến - 200C. Các tinh thể băng khi lớn lên có hình giống như một chiếc lông chim hoặc cây dương xỉ, thậm chắ ở - 400C, với không gian khá chật giữa các tinh thể, tinh trùng vẫn lơ lửng giữa những khoảng hở này. Khi dung dịch ựược làm ấm lên, các tinh thể băng tan chảy chậm, nhưng không thay ựổi nhanh chóng như trước ựó. Bằng cách này, glycerol có tác dụng như là một chất hòa tan muối và làm giảm bớt những thay ựổi vật lý học khi làm ựông lạnh và giải ựông (Hiroshi, 1992) [49].
b. Glycerol ựi vào tế bào
Trong môi trường pha loãng tinh glycerol ngấm vào tinh trùng thay thế nước bị mất ựi làm cho tế bào tinh trùng không bị teo. Glycerol làm cho nước ựông băng ở dạng hạt nhỏ, loại trừ ựược sự dãn nở của tinh thể nước nội bào, chống ựược sự phá vỡ tế bào, nó còn giữ ựược sự ổn ựịnh nồng ựộ của các chất hoà tan, không làm thay ựổi áp suất thẩm thấu, hạn chế việc phá vỡ các protein của tinh trùng (Hiroshi, 1992) [49].
2.1.6.5. Tác dụng của kháng sinh trong môi trường pha loãng
Trong môi trường pha loãng tinh dịch thường có một lượng kháng sinh nhất ựịnh, thường là peniciline và streptomycine. Peniciline có tác dụng ức chế tổng hợp các mucopeptid của vỏ tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn trưởng thành, vỏ tế bào mỏng ra tại một số ựiểm ựể chuẩn bị phân bào, tại các ựiểm ựó peniciline phong bế men chuyển hóa peptit, làm cho vỏ tế bào vi khuẩn không ựược bổ sung, trong lúc lượng xuất tinh của nguyên sinh chất vẫn tăng làm tế bào vi khuẩn vỡ (Hoàng Tắch Huyền, 1994) [20]. Vỏ tế bào vi khuẩn gram dương chứa 60% mucopeptit, nên chịu tác ựộng và phân hủy theo cơ chế của peniciline, các vi khuẩn gram âm chỉ có 10% mucopeptit, nên không mẫn cảm với penicilin. Steptomycine làm tổn hại ựến ARN thông tin, làm cho ARN thông tin chọn nhầm các axắt amin, tạo ra một ựa peptit khác, protein ựặc trưng
không hình thành do ựó vi khuẩn mới không ựược tạo nên (Hoàng Tắch Huyền, 1994) [20].