3.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi tảo ñộc hại
3.2.1.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu
Phương pháp thu và phân tích mẫu vi tảo ñộc tuân theo Hallegraeff et al. (2004) (Manual for Harmul Algae Study - UNESCO). Cụ thể là:
Mẫu ñịnh tính: Mẫu ñịnh tính tảo ñộc hại ñược thu bằng lưới thực vật phù du ñường kính 30 cm, kích thước mắt lưới 20 µm bằng cách kéo nhiều lần từ tầng ñáy lên tầng mặt. Mẫu ñược ñựng trong chai nhựa 100 ml, cốñịnh ngay tại hiện trường bằng dung dịch formaline 2% .
Mẫu ñịnh lượng: Mẫu ñịnh lượng tảo gây hại ñược thu bằng xô nhựa sau ñó ñược chuyển sang chai nhựa có thể tích mẫu thu 1 lít, cốñịnh tại hiện trường bằng dung dịch formaline 4 - 5% lắc ñều và bảo quản trong bóng tối.
Tại phòng thí nghiệm, mẫu ñịnh lượng và ñịnh tính ñược ñể lắng trong bóng tối từ 24 - 48h, sau ñó ñược siphone ñể rút dần nước trong các lọ mẫu cho ñến khi bắt ñầu xuất hiện vẩn. Sau ñó, mẫu ñược chuyển sang ống ñong hình trụ 100 ml và tiếp tục ñể lắng ít nhất 24 h rồi tiếp tục siphone rút hết nước cho ñến khi xuất hiện vẩn thì dừng lại. Quá trình này ñược lặp lại nhiều lần cho ñến khi thể tích trong ống ñong còn lại còn 5 - 10 ml. Khi ñó, mẫu ñược chuyển sang lọ nhỏ 50 ml, bổ sung thêm lugol và một lượng nhỏ formalin, bảo quản trong ñiều kiện nhiệt ñộ thường, tránh ánh sáng.
3.2.1.2. Phương pháp phân tích mẫu
Mẫu ñịnh tính: ðược phân tích bằng cách quan sát dưới kính hiển vi thường, ở ñộ phóng ñại 100 - 400 lần. ðối với những tế bào khó phân loại hoặc có nghi ngờ về phân loại, mẫu sẽñược phân lập bằng pipet pasteur thủy tinh kéo nhỏñể giám ñịnh loài ởñộ phóng ñại cao hơn (1000 lần).
Mẫu ñịnh lượng: Khi phân tích, tiến hành lắc ñều lọ mẫu rồi dùng pipet tự ñộng hút lấy 1 ml dung dịch mẫu cho vào buồng ñếm Sedgewick-Rafter, ñể
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 18 lắng khoảng 15 phút và ñếm số lượng tế bào của từng loài dưới kính hiển vi Olympus CHD 24, ởñộ phóng ñại từ 40 ñến 400 lần. ðối với loài có tần suất xuất hiện cao, sử dụng máy ñếm hỗ trợ cho việc ñếm tế bào. Có thểñếm một phần, một nửa hoặc cả buồng tùy vào mật ñộ tế bào trong mẫu nhiều hay ít. Trên cơ sở tham khảo danh mục loài thu ñược từ phân tích mẫu ñịnh tính, mật ñộñộ tảo (X) trong thủy vực ñược tính theo công thức sau:
X = A x 104/a(tb/lít)
Trong ñó: A: Số tế bào ñếm ñược trong 100 ô trên buồng ñếm. a: Hệ số cô ñặc
Tài liệu căn cứñể phân loại
Tảo ñộc ñược phân loại dựa theo một số tài liệu của các tác giả sau:
Balech (1995), Dodgle (1982), Dodgle (1985), Fukuyo et al. (1990), Larsen & Moestrup (1999), Taylor (1976), Taylor et al. (1995), Tomas (1996), Shirota (1996), Nguyen Van Nguyen (2003), Larsen & Nguyen, 2004, Chu Văn Thuộc, 2006, Trương Ngọc An (1993), Tomas (1996), Taylor et al. (1995)...
3.2.1.3. Phương pháp thử nghiệm nhận dạng nhanh tảo ñộc Alexandrium catenella bằng ñầu dò huỳnh quang
Các loài tảo thuộc nhóm Alexandrium có kích thước tế bào bé, khó cho việc phân loại bằng kính hiển vi thường. Do vậy, trong nghiên cứu này khả năng ứng dụng phương pháp ñầu dò phân tử trong phân loại tảo ñộc Alexandrium catenella
bước ñầu ñược thăm dò và thử nghiệm (Hình 3-2)
Nguyên lý của phương pháp ñầu dò phân tử: Mỗi loài tảo ñều có một trình tự ARN ñặc hiệu riêng. Trong ñó, vùng D2 của gen ARNr 28S có chứa một trình tự ñặc hiệu loài của nhóm tảo Alexandrium. Dựa vào ñặc ñiểm này các nhà khoa học ñã thiết kế ra các ñầu dò gắn sẵn chất huỳnh quang 5-isothionate ñặc hiệu cho từng loài. Tiến hành các quá trình lai (Hình 3-2) nếu có mặt loài có trình tự gen phù hợp với ñầu dò ñặc hiệu cho loài ñó thì ñầu dò phân tửñược gắn vào ñầu 5’ của trình tự gen ARN 28S và cho ánh sáng xanh dưới ánh sáng huỳnh quang.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 19
Hình 3-2: Quy trình ứng dụng phương pháp ñầu dò phân tử trong phân loại vi tảo ñộc hại nhóm Alexandrium.
Trong ñó bước tiến hành lai ñược thực hiện theo các bước sau:
+ Ly tâm 1mL mẫu (khoảng 10.000 tb) với tốc ñộ 3.000 vòng/p trong 1 phút, ở 40C, sau ñó thu tế bào.
+ Cố ñịnh tế bào bằng 1 mL dung dịch PBS (5x) có chứa paraformandehyde (4%), ủ mẫu trên ñá lạnh trong 5 phút.
+ Ly tâm thu tế bào (3.000 vòng/p trong 1 phút, ở 40C).
+ Thêm 1 mL dung dịch ethanol 50% vào mẫu, ủ trên ñá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3.000 vòng/p trong 1 phút, 40C).
+ Thêm 1 mL dung dịch ethanol 80% vào mẫu, ủ trên ñá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3.000 vòng/p trong 1 phút, 40C).
+ Lai với ñầu dò gắn huỳnh quang: Thêm 500 µL dung dịch lai (Formamide (40%), SSC (5x), mẫu dò có gắn huỳnh quang (50 pmol)). Ủ tế bào ở 400C trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3.000 vòng/p trong 1 phút, 40C).
+ Rửa 2 lần:
Thu mẫu ngoài hiện trường
Bảo quản ở 4oC và chuyển ngay về phòng thí nghiệm Mẫu ñược ủ trong ñiều kiện 15oC trước khi xử lý ðọc kết quả Tiến hành lai (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 20 Thêm 1mL SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 500C trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3.000 vòng/p trong 1 phút, 40C).
Thêm 1mL SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 500C trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3.000 vòng/p trong 1 phút, 40C).
+ Mẫu sau khi thu, ñược bảo quản và ñể trong tối (-200C hoặc -800C).
Các dung dịch sử dụng trong quá trình lai gồm:
+ Dung dịch PBS: NaCl (684 mM), Na2H2PO4.12H2O (405 mM), pH 7,5, KCl (14 mM), KH2PO4 (7,5 mM).
+ Dung dịch ðệm lai SSC 5X: NaCl (83 mM), Sodium Citrate (83 mM), pH 7,0
Dụng cụ thí nghiệm chính gồm
+ ðầu dò FITC – 5’Act ñặc hiệu ñối với loài Alexandrium catenella (kí hiệu Act). Trình tự ñầu dò Act: 3’-ACCCAAAACCGACGTTCACG-5’ ñược thiết kế dựa trên trình tự ARN ribosome của vùng D2 thuộc tiểu phần 28S. + Mẫu ñược quan sát bằng kính epifluorescence microscopy (ECLIPSE E600,
Nikon) với bộ lọc B2A (EX450-490, DM505, BA520).
Bố trí thí nghiệm:
Do ñiều kiện thời gian và kinh phí nên chỉ thử nghiệm ñầu dò ñể nhận dạng nhanh loài tảo ñộc Alexandrium catenella, mặt khác các loài tảo Alexandrium khá giống nhau về mặt hình thái nên cần phải tiến hành thử nghiệm ñầu do Act với một số loài trong giống Alexandrium và giống khác ñược thể hiện trong Bảng 3-1.
Bảng 3-1: Bố trí thí nghiệm thử nghiệm ñầu dò Act
ðầu dò Loài thí nghiệm Ghi chú
Alexandrium catenella Alexandrium tamarense Prorocentrum micans Alexandrium leei
Mẫu ñược nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
Act
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 21
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu các thông số môi trường
3.2.2.1. Phương pháp thu mẫu
- Các thông số nhiệt ñộ, DO, pH, ñộ muối, ñộ trong ñược ño ngay tại hiện trường.
- Các mẫu muối dinh dưỡng NH4+; NO3-, Si2O3-, PO43- ñược thu bằng xô nhựa. Ngay sau khi thu, mẫu ñược chuyển sang chai nhựa 1 lít và bảo quản trong ñiều kiện lạnh ≤ 40C.
3.2.2.2. Phương pháp phân tích mẫu
Nhiệt ñộ và hàm lượng DO ñược ño tại hiện trường bằng máy DO (YSI 52 – Mỹ); ñộ pH ño bằng máy ño pH (WTW - 320i); ðộ muối ño bằng khúc xạ kế (ATAGO - Nhật Bản); ñộ trong ño bằng ñĩa sechi ñường kính 30 cm.
Muối NH4+ ñược phân tích theo phương pháp Phenat; phân tích bằng phương pháp cột khửñối với NO3-; phương pháp acid ascorbic và so màu quang phổñối với PO43- và phân tích theo phương pháp so màu thêm chuẩn Si2O3- dựa trên phản ứng của Si2O3- với ammoni molybdate tạo phức (Si2O3.12MoO3.nH2O) có màu vàng ñối với muối Si2O3-.