F: cgagagagcccataactacg
2.2.Nội dung nghiên cứu
- đánh giá một số ựặc tắnh nông sinh học, các ựặc ựiểm sinh hóa, khả năng chống sâu bệnh hại chắnh của các giống lúa nương,
- đánh giá ựa dạng di truyền các giống lúa nương bằng chỉ thị SSR, - Nghiên cứu phân loại dưới loài các giống lúa nương.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trắ thắ nghiệm
- Bố trắ thắ nghiệm ựánh giá tập ựoàn theo phương pháp tuần tự không nhắc lại, mỗi giống 8m2 (2 x 4 m).
- Mật ựộ: 45 khóm/m2.
- Các khâu kỹ thuật trồng và chăm sóc theo ựại trà sản xuất.
2.3.2. Các tắnh trạng theo dõi và ựánh giá
Theo hướng dẫn của IRRI, 1996 [18], quá trình sinh trưởng của cây lúa ựược chia thành 9 giai ựoạn như sau:
Giai ựoạn 1: Nảy mầm Giai ựoạn 4: Vươn lóng Giai ựoạn 7: Chắn sữa Giai ựoạn 2: Mạ Giai ựoạn 5: Làm ựòng Giai ựoạn 8: Vào chắc Giai ựoạn 3: đẻ nhánh Giai ựoạn 6: Trỗ bông Giai ựoạn 9: Chắn
Các tắnh trạng theo dõi và ựánh giá ựược thực hiện theo Hệ thống ựánh giá tiêu chuẩn cây Lúa của IRRI, 1996 [11].
2.3.3. đánh giá khả năng kháng rầy nâu, bệnh bạc lá
* đánh giá tắnh kháng rầy nâu(Nilaparvata lugens Stal.)
Các giống ựánh giá ựược gieo vào ô bàn cờ 50 ô, mỗi giống ựược gieo trên 3 ô, mỗi ô 15 hạt, tống số 45 hạt cho 3 lần gieo nhắc lại ngẫu nhiên. Các
giống ựối chứng kháng, nhiễm gieo mỗi giống 1 ô. Viền xung quanh ô bàn cờ là giống nhiễm TN1.
Mạ ựược 3 - 4 lá thật bắt ựầu thả rầy tuổi 2, thả theo 5 ựiểm, ựảm bảo 5 - 6 con rầy cho 1 tép mạ.
Theo dõi mạ theo mốc thời gian là sau 3 ngày, 5 ngày và 7 ngày ựến khi giống ựối chứng TN1 bắt ựầu cháy thì tiến hành ựánh giá theo thang ựiểm của IRRI.
Bảng 2.3. Tiêu chuẩn ựánh giá kháng và nhiễm rầy nâu theo IRRI
Cấp
ựộ
Mức gây hại với cây chủ đánh giá Ký
hiệu
0 Cây phát triển bình thường, không bị hại Kháng cao KC 1 Cây phát triển bình thường, lá 1 và 2 bị vàng Kháng K 3 Có 10% cây chết, lá 1, 2 bị vàng Kháng vừa KV 5 Có 20 Ờ 50% số cây chết, lá 1, 2 và 3 bị vàng Nhiễm vừa NV 7 Trên 50% số cây vàng và không phát triển ựược Nhiễm N
9 Cây bị chết hoàn toàn Nhiễm cao NC
Tại thời ựiểm cây TN1 chết hoàn toàn, những cây còn sống sót ựược coi là cây kháng, còn những cây chết ựược coi là nhiễm.
Nguồn rầy ựánh giá cho tập ựoàn lúa nương: Rầy nâu thu thập tại Hoà Bình.
* đánh giá tắnh kháng bệnh bạc lá (Xanthomonas oryza)
Các giống ựánh giá sau khi ựược gieo mạ, nhổ cấy vào xô, mỗi giống cấy 2 khóm/xô, 5 xô/1 lần nhắc lại, 3 lần nhắc lại/giống (mỗi giống 15 xô).
Bón phân và chăm sóc như quy trình cấy lúa của ựại trà sản xuất ngoài ựồng. Sau cấy 40 ngày, giai ựoạn ựẻ nhánh tiến hành lây bệnh nhân tạo theo phương pháp cắt ựỉnh lá bằng dịch khuẩn từ nguồn lá bệnh tươi, hoặc nguồn bệnh nhân tạo ựược nuôi nhân trong phòng thắ nghiệm. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn bạc lá (Xanthomonas oryza) là môi trường Wakimoto, PDA.
Nguồn bệnh bạc lá thu thập trên giống Khang dân tại Lạc Thuỷ, Hoà Bình ựểựánh giá cho tập ựoàn lúa nương.
đánh giá tắnh chống chịu bệnh bạc lá sau khi lây bệnh nhân tạo 10 ngày theo thang 9 cấp của IRRI. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.4. Tiêu chuẩn ựánh giá kháng và nhiễm bạc lá theo IRRI
Cấp ựộ Mức gây hại với cây chủ đánh giá Ký hiệu
1 Chiều dài vết bệnh từ 0 - 1cm Kháng cao KC 3 Chiều dài vết bệnh từ >1 - 3cm Kháng K 5 Chiều dài vết bệnh từ >3 - 6cm Kháng trung bình KTB 7 Chiều dài vét bệnh từ > 6 - 10cm Nhiễm N 9 Chiều dài vết bệnh từ >10cm Nhiễm nặng NN
2.3.4. Các ựặc ựiểm sinh hoá
- Hương thơm: Mỗi giống sử dụng 30 hạt gạo, ngâm vào 20 ml dung dịch KOH 0,1 N trong 5 phút ở nhiệt ựộ 50oC. Sau ựó xác ựịnh ựộ thơm bằng cảm quan.
- Phân loài phụIndica, Japonica: Mỗi giống lúa sử dụng 10 hạt thóc, ngâm trong dung dịch 1,5% phenol (C6H6OH) trong 6 giờ. Sau ựó hong khô ở nhiệt ựộ 30oC trong hai ngày (48 giờ) ựể xác ựịnh sự bắt màu của hạt thóc.
Những giống có hạt thóc chuyển sang màu nâu ựỏ là lúa Indica, không chuyển màu là lúa Japonica.
- độ phân huỷ kiềm: đánh giá ựộ phân huỷ kiềm theo phương pháp của IRRI (1996) [18]. Mỗi giống sử dụng 10 hạt gạo ngâm vào dung dịch 1,7% KOH trong 23 giờở 30oC.
Bảng 2.5. Tiêu chuẩn ựánh giá ựộ phân hủy kiềm theo IRRI
Phân huỷ kiềm Nhiệt ựộ
hoá hồ
1 Hạt gạo không ảnh hưởng nhưng có màu
phấn trắng Thấp Cao
2 Trương lên Thấp Cao
3 Trương lên nhưng cổ hạt trương không hoàn toàn và hẹp
Thấp hoặc Trung bình
Cao hoặc trung bình 4 Trương lên, cổ hạt trương hoàn toàn và rộng Trung bình Trung bình 5 Vỡ ra hoặc bị phân ựoạn, cổ hạt trương hoàn
toàn và rộng Trung bình Trung bình
6 Tỏa lan và hoà trộn với cổ hạt Cao Thấp
7 Tan hoàn toàn và trong suốt Cao Thấp
- Hàm lượng amylose: được xác ựịnh theo phương pháp của Juliano (1985) [54].
+ Trên 25%: Cao
+ Từ 20% ựến 25%: Trung bình + Dưới 20%: Thấp
2.3.5. Nghiên cứu ựa dạng di truyền và phân loại dưới loài các giống lúa
nương bằng chỉ thị AND
2.3.5.1. Tách chiết ADN
Tách ADN từ lúa ựược tiến hành theo theo phương pháp CTAB của Doyle và ựồng tác giả có cải tiến (1987).
Bước 1: Ủ sẵn 5 ml ựệm chiết ở nhiệt ựộ 650C trong bình ổn nhiệt (30 phút),
Bước 2: Nghiền 0,5 ựến 1g mô lá thực vật trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ cho ựến khi thành bột mịn,
Bước 3: Hoà tan mẫu ựang nghiền trong ựệm chiết, tiếp tục nghiền thêm một chút ựể mẫu nghiền tạo thành dạng ựồng nhất, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 4: Ủ mẫu ở nhiệt ựộ 650C trong thời gian 30 phút, lắc ựều 3 ựến 5 lần trong quá trình ủ,
Bước 5: Thêm một thể tắch dung dịch bao gồm Chloroform và Isoamyl alcohol có tỷ lệ 24 : 1; lắc ựều,
Bước 6: Ly tâm tốc ựộ 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút,
Bước 7: Chuyển phần dịch phắa trên sang ống sạch, sau ựó cho thêm thể tắch dung dịch Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), lắc ựều,
Bước 8: Ly tâm 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút,
Bước 9: Chuyển phần dịch phắa trên sang ống sạch. Thêm vào ựó dung dịch Isopropanol với thể tắch tương ứng với 2/3 thể tắch mẫu. để mẫu ở nhiệt ựộ 200C trong thời gian 20 phút,
Bước 10: Ly tâm 13000 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt ựộ 40C, thu kết tủa,
Bước 11: Rửa kết tủa bằng Ethanol 80%. Ly tâm với tốc ựộ 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở nhiệt ựộ 40C,
Bước 12: để kết tủa khô trong ựiều kiện nhiệt ựộ phòng. Hoà tan kết tủa trong dung dịch TE 0,1X (dung dịch Tris-HCl: EDTA = 10:1). Giữở nhiệt ựộ 200C ựể dùng dần.
Dùng enzyme ARNase ựể loại bỏ các ARN, ựểựược AND tinh khiết. 2.3.5.2. Kiểm tra ựộ tinh sạch và xác ựịnh hàm lượng ADN
độ tinh sạch ADN của lá lúa ựược kiểm tra bằng cách xác ựịnh OD ở 260nm và OD ở 280nm trên máy quang phổ kế. Tỷ lệ OD260/OD280 cho biết ựộ tinh sạch của mẫu ADN. Tỷ lệ này ựược sử dụng trong khoảng từ 1,6 ựến 1,8.
Hàm lượng ADN ựược tắnh theo công thức: ADN (ộg/ộl) = (OD260 x 50ộg/ộl)/1000 2.3.5.3. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR ựược chuẩn bị trong eppendorf 0,2ml và thực hiện trên trên máy Programmable Thermal Controller (MJ-Research Inc. PTC-200).
Thành phần của mỗi phản ứng thể hiện trong bảng sau: Bảng 2.6. Thành phần của mỗi phản ứng PCR STT Thành phần Thể tắch 1 H2O cất khử trùng 5,24 2 PCR buffer 10X 2,0 3 MgCl2 (50mM) 0,16 4 dNTPs (2,0mM) 0,4 5 Mồi Forward (25ng/ộl) 0,4 6 Mồi Revert (25ng/ộl) 0,4 7 Taq (5U) 0,4 8 ADN (30ng/ộl) 1,0 Tổng thể tắch 10,0
- Chu trình của phản ứng PCR ựược biểu diễn theo sơựồ sau:
Hình 2.1. Sơựồ chu trình của phản ứng PCR
(*): Nhiệt ựộ gắn mồi: Có thể thay ựổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể
- Sản phẩm của phản ứng PCR ựược kiểm tra kết quả trên gel agarose 1,5%, ựệm TAE 1X.
2.3.5.4. Phương pháp phân tắch kết quả trên gel polyacrylamide
a. Chuẩn bị gel polyacrylamide
1. Lau kắnh 3 lần bằng nước cất, 2 lần bằng ethanol 95% với giấy mềm, 2. Chuẩn bị dung dịch gắn (Binding solution): 3ộl Bind Silane + 1ml acetic
axit 0,5% trong 95% ethanol. Lau ựều dung dịch gắn lên tấm kắnh 1 bằng giấy mềm. để khô 5 phút,
3. Cho 3ml Sigmacote lên bề mặt tấm kắnh 2. Phủựều Sigmacote lên tấm kắnh bằng giấy mềm khô. để khô 5 phút,
4. Lắp ráp kắnh ựểựổ gel,
5. Thêm 100 ộl TEMED (N,N,NỖ,NỖ-Tetraethyl - Ethylendiamine) và 500 microlit APS 20% vào dung dịch Acrylamide 4,5% (50,4g Urea: 12 ml TBE 10X: 13,5ml Acrylamide/Bis-acrylamide 40% (19:1) trong 120ml dung dịch). Trộn nhanh. Bơm dung dịch vào giữa hai tấm kắnh bằng xylanh 140cc, tránh không ựể tạo bọt khắ, 5Ỗ 30ỖỖ 72 oC 72 oC 55oC* 1Ỗ 5Ỗ 4 oC 94 oC 94 oC
6. Cài lược vào gel (6-8mm),
7. để gel ựông tự nhiên ắt nhất 1 giờ.
b. điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide
1. Rút lược ra khỏi gel. Lau sạch gel dắnh phắa trên khuôn gel bằng nước cất,
2. Dựng gel lên giá chạy. đổ 2 lắt TBE 1X (10,8g Tris base: 0,92g EDTA: 5,52g Boric acid trong 1 lắt dung dịch) vào phắa trên và dưới của khoang ựệm. Chạy gel ở 90W ựể bề mặt gel ựạt tới nhiệt ựộ 50oC, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Chuẩn bị mẫu:
Thêm STR 3X với tỷ lệ thể tắch là 1 STR: 2 mẫu,
Biến tắnh mẫu và marker 5 phút ở nhiệt ựộ 94oC. đưa ngay vào ựá. 4. Dùng xylanh ựuổi hết bọt khắ ở bề mặt phắa trên của khuôn gel
Cài răng lược vào gel (1 - 2mm). Tra 8ộl từng mẫu vào giếng, Chạy gel trong thời gian 2 giờởựiều kiện 60W, 5oC.
c. Nhuộm bạc
- Sau khi hoàn thành quá trình chạy ựiện di, tháo gel khỏi giá chạy, rút lược ra khỏi gel. Gỡ kắnh ra một cách nhẹ nhàng. Gel ựược giữ trên tấm kắnh. Làm sạch phần kắnh xung quanh gel bằng nước cất,
- đặt gel vào khay,
Nhuộm bạc theo các bước như sau:
1. Hãm gel trong dung dịch hãm (Glacial acetic acid 10%) 30 phút, 2. Rửa 3 lần bằng nước cất, mỗi lần 2 phút,
Formadehyde 37% trong 2 lắt dung dịch) 30 phút, 4. Rửa gel bằng nước cất không quá 10 giây,
5. đưa gel vào dung dịch hiện (4 - 10oC) (60g Sodium carbonate: 3ml Formaldehyde (H2CO) 37%: 400ộl Sodium thiosulfate (Na2S2O.5H2O) (10mg/ml) trong 2 lắt dung dịch) từ 2 - 5 phút ựến khi các băng ADN hiện rõ,
6. Hãm gel trong dung dịch hãm 3 - 6 phút, 7. Rửa bằng nước cất 2 - 3 phút,
Chú ý: Tất cả các bước trên ựều thực hiện trên máy lắc, 8. để gel khô tự nhiên qua ựêm,
9. Sấy gel ở 50oC trong 5 giờ, 10. Ghi nhận kết quả.
2.3.6. Phân tắch và xử lý số liệu
- Số liệu ựánh giá các tắnh trạng hình thái nông học ựược phân tắch, xử lý trên phần mềm Excel,
- Số liệu ADN ựược phân tắch trên phần mềm NTSYS Version 2.1.
Hệ số tương ựồng di truyền và khoảng cách di truyền theo công thức của Nei (1972) [73]: I = 2 1 12 Q Q q và D = - ln (I)
Trong ựó: I: Hệ số tương ựồng di truyền, D: Khoảng cách di truyền,
q12: Số các alen ựồng nhất ở cả 2 mẫu, Q1 và Q2: Tổng số các alen của giống 1 và 2.
Hệ số ựa dạng gen hay giá trị lượng thông tin ựa hình (PIC: Polymorphism Information Content) ựược tắnh theo công thức của Powel và cộng tác viên (1996) [78], Smith và cộng tác viên (1997) [85].
PIC = 1 - ∑hk
2 (hk: tần số xuất hiện của alen thứ k)