dày lớp cutin và hàm lượng Silic tự nhiên ñến sự gây hại của nhện gié
Thí nghiệm ñược tiến hành trên 35 giống (trùng với các giống ở thí nghiệm 1).
* Dùng cây lúa ở giai ñoạn trỗ ñem ño kích thước khoang mô, ñộ dày tầng cutin như sau:
Phương pháp xử lý mẫu:
- Mẫu ñem xử lý là các bẹ lá lúa và gân lá lúa.
- Thu mẫu: Thu mỗi giống 30 mẫu, các mẫu thu ñảm bảo không bị sâu, héo, úa hay hỏng do thời tiết (ñểñảm bảo tính toàn vẹn của tiêu bản)
- Sau khi thu mẫu cần rửa sạch bùn ñất bám trên lá, bẹ rồi ñể cho ráo nước
- ðưa các mẫu ñã thu ñược vào dung dịch cồn 50% ñể cốñịnh tạm thời. - Mẫu ñược ñưa về phòng thí nghiệm ñể tiếp tục xử lý
+ Thay dung dịch cồn 50% cố ñịnh tạm thời bằng dung dịch FAA ñể giữ mẫu trong thời gian dài và cố ñịnh toàn bộ các tổ chức mô. Trong tuần ñầu tiên liên tục kiểm tra chất lượng dung dịch cố ñịnh, nếu dung dịch ngả màu nâu ñen ngay lập tức rửa sạch mẫu và chuyển sang dung dịch mới. ðối với mẫu lá lúa và bẹ lá lúa chỉ cần chuyển 1 lần vì lá, bẹ lúa khô, ít dịch chứa trong các khoang mô nên chất lượng dung dịch cốñịnh ñược ñảm bảo.
+ Các mẫu ñược sử dụng phương pháp cắt mỏng bằng tay, nhuộm kép, chụp ảnh, ño kích thước bằng trắc vi thị kính và trắc vi vật kính của ðức cụ thể như sau:
- Phương pháp cắt:
Các mẫu ñều ñược cắt ngang những lát thật mỏng (mỗi số hiệu ñược cắt riêng biệt ñể trong từng ñĩa ñồng hồ ñể ñảm bảo không lẫn mẫu, cắt mẫu lần lượt theo các số hiệu ñã ñược ñánh số). Mẫu cắt ñược lấy từ các phần khác nhau của bẹ, của lá ñể lấy giá trị trung bình: Ví dụ lá lúa sẽñược cắt ở 3 vị trí: Phần phiến lá gần bẹ, phần giữa phiến lá và phần phiến lá gần chóp lá.
- Phương pháp nhuộm:
Các vi phẫu sau khi ñược cắt mỏng sẽñem nhuộm trong các dung dịch. Từng bước nhuộm như sau:
Ngâm mẫu vừa cắt vào nước Javen 15-20 phút (tuỳñộ dày của mẫu) ñể loại hết nội chất của tế bào (chú ý cắt ñược tới ñâu ngâm ngay tới ñó tuyệt ñối không ñể khô mẫu trên dao hay trên thớt cắt).
Rửa sạch mẫu bằng nước (tối thiểu 3 lần) tùy ñộ nhiều của mẫu.
Ngâm mẫu vào dung dịch axit axetic 5% trong 5 phút (ñể trung hoà hết Javen còn sót lại) tránh làm mất màu mẫu nhuộm sau này.
Rửa sạch mẫu bằng nước.
Nhuộm mẫu lần 1 trong dung dịch carmin phèn chua từ 20 ñến 30 phút (ñối với những mẫu ñem cố ñịnh thì nhuộm trong vòng 3 ñến 4 giờ hoặc 10 giờ trong ñiều kiện nhiệt ñộ 4-5oC).
Rửa sạch mẫu bằng nước.
Nhuộm mẫu lần 2 trong dung dịch xanhmethylen 1% từ 30” ñến 1 phút (ñối với những mẫu ñem cốñịnh thì nhuộm trong vòng 30 phút ñến 1 giờ). Sau ñó lấy mẫu ra rửa sạch và lên kính quan sát.
- Phương pháp chụp ảnh:
Các mẫu sau khi nhuộm xong, chọn những mẫu ñẹp, sắc nét lên kính và tiến hành chụp ảnh. Máy ảnh có thể sử dụng máy ảnh gắn trực tiếp với kính hiển vi hoặc máy ảnh kĩ thuật số bình thường chụp ngoài qua thị kính. ðối với
máy ảnh chụp ngoài cần chụp ở chếñộ MACRO.
Chỉ tiêu chụp: Hình thái của gân, sự phân bố của các khoang chứa khí, lột tả bó dẫn, mô cứng và các tổ chức bị tổ thương do sự xâm nhập của nhện
- Phương pháp ño: Sử dung trắc vi thị kính ño kích thước khoang mô và ñộ dày tầng cutin ở các ñộ phóng ñại khác nhau: 40 lần, 100 lần và 400 lần. ðơn vị tính là µm.
* Phương pháp xác ñịnh hàm lượng Silic tự nhiên
Cắt 35 giống lúa (các giống lúa ở thí nghiệm 1) giai ñoạn lúa chín (cắt sát gốc), mỗi giống cắt 10 khóm ñem về ñánh dấu, cắt bỏ phần bông lúa, phơi khô 5 nắng. Sau ñó ñem sấy ở tủ sấy (sấy nhiệt ñộ 80oC trong 2 tiếng ñồng hồ). Tiến hành ñốt lấy tro. ðem gửi ñi phân tích hàm lượng Silic trong mẫu tro tại phòng thí nghiệm bộ môn Hoá phân tích, khoa ðất và Môi trường, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. Cân khối lượng mẫu trước khi sấy, sau khi sấy, sau khi ñốt.
Phương pháp phân tích hàm lượng Silic trong mẫu tro: Nung chảy tro thực vật với Na2CO3, tách Silic dưới dạng axit Silixic bằng HClO4 nồng ñộ 2 M. Rửa kết tủa bằng dung dịch HCl nồng ñộ 2M. Sau ñó sấy khô kết tủa ở nhiệt ñộ 110oC và tiến hành cân. (Viện Thổ nhưỡng nông hoá 1998).