3.2.1. Lựa chọn hàm lượng cao:
Bảng 3.6. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng cao thích hợp.
C1 C2 C3 C4
Cao Diếp cá 30% 40% 50% 60%
MgCO3 9% 12% 15% 18%
PVP K30 2% 2% 2% 2%
Talc 1% 1% 1% 1%
Bảng 3.7. Độ ẩm các công thức C1, C2, C3, C4.
Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 Trung bình C1 3,62% 3,73% 3,80% 3,72%
C2 3,94% 4,04% 4,03% 4,00%
C3 4,57% 4,63% 4,60% 4,60%
C4 5,30% 5,44% 5,59% 5,44%
Nhận xét: Công thức với hàm lượng cao 60% có độ ẩm > 5%, vì vậy công thức với hàm lượng cao 50% được chọn.
3.2.2. Lựa chọn hàm lượng tá dược hút:
Bảng 3.8. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng tá dược hút.
H1 H2 H3 H4 Cao Diếp cá 50% 50% 50% 50% MgCO3 0% 5% 10% 15% Tá dược độn B 47% 42% 37% 32% PVP K30 2% 2% 2% 2% Talc 1% 1% 1% 1% Bảng 3.9. Độ ẩm các công thức H1, H2, H3, H4.
Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 Trung bình
H1 - - - -
H2 5,52% 5,38% 5,00% 5,30%
H3 4,86% 4,75% 4,73% 4,78%
H4 4,40% 4,52% 4,43% 4,45% Chú thích: (-) các công thức không thực hiện được.
Nhận xét: Khi cho ̣n hàm lượng MgCO3 ≥ 10% thì công thức đạt độ ẩm ≤ 5%. Vì vậy, chúng tôi chọn hàm lượng MgCO3 ở 2 mức 10% và 15% để đưa vào thiết kế công thức.
3.2.3. Lựa chọn công thức tối ưu cho viên nang chứa cao Diếp cá:Bảng 3.10. Các công thức thiết kế tối ưu công thức viên nang. Bảng 3.10. Các công thức thiết kế tối ưu công thức viên nang.
Công thức Cao Diếp cá Magnesi carbonat Tá dược độn A Tá dược độn B PVP K30 Talc T1 50% 10% 27,7% 9,3% 2% 1% T2 50% 10% 24,7% 12,3% 2% 1% T3 50% 10% 18,5% 18,5% 2% 1% T4 50% 10% 12,3% 24,7% 2% 1% T5 50% 10% 9,3% 27,7% 2% 1% T6 50% 15% 27,7% 9,3% 2% 1% T7 50% 15% 24,7% 12,3% 2% 1% T8 50% 15% 18,5% 18,5% 2% 1% T9 50% 15% 12,3% 24,7% 2% 1% T10 50% 15% 9,3% 27,7% 2% 1% 3.2.3.1. Độ ẩm: Bảng 3.11. Độ ẩm các công thức khảo sát (T1 – T10). T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 Lần 1 4,73% 4,71% 4,80% 4,70% 4,75% 4,52% 4,54% 4,60% 4,53% 4,60% Lần 2 4,70% 4,68% 4,73% 4,75% 4,80% 4.51% 4,51% 4,70% 4,56% 4,56% Lần 3 4,76% 4,71% 4,72% 4,71% 4,87% 4,47% 4,45% 4,68% 4,56% 4,67% TB 4,73% 4,7% 4,75% 4,72% 4,81% 4,50% 4,50% 4,66% 4,55% 4,61%
Nhận thấy các công thức đều có độ ẩm <5% , đạt yêu cầu về độ ẩm.
3.2.3.2. Góc chảy:
Bảng 3.12. Góc chảy các công thức khảo sát (T1 – T10).
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
h 3,4 3,8 3,5 3,5 3,5 3,4 3,1 3,5 3,4 3,5
r 4,5 4,8 4,7 4,5 4,6 5 4,7 4,5 4,5 4,6
tgα 0,756 0,792 0,745 0,778 0,761 0,680 0,660 0,778 0,756 0,761
α 37,1o 38,4o 36,7o 37,9o 37,3o 34,2o 33,4o 37,9o 37,1o 37,3o
Nhận xét: các công thức khảo sát đều có góc chảy tốt, phù hợp để đóng nang.
3.2.3.3. Tỷ trọng biểu kiến:
Bảng 3.13. Tỷ trọng biểu kiến của các công thức khảo sát (T1 – T10).
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Vsvđ (ml) 67 68 69 66 64 70 67 66 67 67
dtvđ (g/ml) 0,64 0,63 0,64 0,67 0,69 0,62 0,66 0,68 0,66 0,66
dsvđ (g/ml) 0,75 0,74 0,72 0,76 0,78 0,71 0,75 0,76 0,75 0,75 Nhận xét: các công thức đều có tỷ trọng sau va đập trong khoảng 0,71 – 0,78. Từ đó tính được phân suất nén < 5%.
3.2.3.4. Phân bố cỡ hạt:
Bảng 3.14. Phân bố cỡ hạt của các công thức khảo sát (T1 – T10).
<0,2 mm 0,2 – 0,3 mm 0,3 – 0,45 mm 0,45 – 0,6 mm T1 42,80% 26,60% 23,30% 7,30% T2 34,58% 25,66% 28,04% 11,72% T3 27,50% 29,10% 31,72% 11,68% T4 9,98% 18,04% 45,14% 26,84% T5 7,04% 22,20% 45,58% 21,44% T6 28,20% 30,72% 32,56% 8,52% T7 20,74% 27,50% 40,02% 11,74% T8 13,36% 25,06% 42,64% 18,84% T9 17,68% 30,00% 37,50% 14,82% T10 13,02% 26,94% 44,36% 15,68%
Hình 3.13. Biểu đồ phân bố cỡ hạt của các công thức từ T6 đến T10. Từ các biểu đồ 3.12. và biểu đồ 3.13. cho thấy:
- Các công thức T1, T2, T3, T6, T7 có tỷ lệ hạt mịn tương đối lớn (> 20%).
- Các công thức T4, T5, T8, T9, T10 có tỷ lệ hạt mịn nhỏ (< 20%) và phân bố cỡ hạt phù hợp cho đóng nang.
3.2.3.5. Độ tan rã:
Bảng 3.15. Độ tan rã các công thức khảo sát (T1 – T10).
Công thức T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Thời gian
rã (phút) 10 10,5 9,5 9 9 8,5 8,5 8 7,5 7,5
Các công thức đều có thời gian rã < 30 phút, đạt yêu cầu về độ tan rã của viên nang theo DĐVN IV. Trong đó công thức T9 và T10 có thời gian rã ngắn nhất.
Từ các kết quả trên chúng tôi chọn công thức T9 làm công thức tối ưu cho viên nang chứa cao Diếp cá.
3.3. KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ:3.3.1. Hình thức cảm quan: 3.3.1. Hình thức cảm quan:
Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng.
3.3.2. Đô ̣ đồng đều khối lượng:
Bảng 3.16. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng.
STT Khối lượng nang thuốc Khối lượng nang rỗng Khối lượng bột thuốc % So với KLTB % Chênh lệch so với KLTB 1 0,5855 0,0969 0,4886 98,74 1,26 2 0,5976 0,0976 0,5000 101,04 1,04 3 0,5732 0,0947 0,4785 96,69 3,31 4 0,5901 0,097 0,4931 99,65 0,35 5 0,5771 0,0956 0,4815 97,30 2,70 6 0,5651 0,089 0,4761 96,21 3,79 7 0,5972 0,0959 0,5013 101,30 1,30 8 0,5812 0,0972 0,4840 97,81 2,19 9 0,5991 0,0989 0,5002 101,08 1,08 10 0,6050 0,0963 0,5087 102,80 2,80 11 0,5942 0,0954 0,4988 100,80 0,80 12 0,5723 0,0922 0,4801 97,02 2,98 13 0,6129 0,0992 0,5137 103,81 3,81 14 0,6053 0,096 0,5093 102,92 2,92 15 0,6135 0,0952 0,5183 104,74 4,74 16 0,5876 0,0997 0,4879 98,59 1,41 17 0,6112 0,0967 0,5145 103,97 3,97 18 0,5783 0,0947 0,4836 97,73 2,27 19 0,5933 0,0901 0,5032 101,69 1,69 20 0,5699 0,0942 0,4757 96,13 3,87 KLTB = 0,4949
3.3.3. Độ tan rã: Thời gian rã: 7,5 phút đạt.
Bảng 3.17. Kết quả đo đô ̣ rã.
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
3.3.4. Độ ẩm: Kết quả trung bình của 3 lần đo là 4,52% đạt.
Bảng 3.18. Kết quả đo đô ̣ ẩm.
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
4,45% 4,6% 4,51% 4,52%
3.3.5. Định tính:
3.3.5.1. Bằng phản ứng hóa học:
Bảng 3.19. Kết quả định tính viên nang chứa cao Diếp cá.
Thuốc thử Kết quả
NaOH 10% Màu vàng sáng (+) FeCl3 5%/ cồn 96% Màu xang đen (+) Mg + HCl đậm đặc Màu đỏ (+)
3.3.5.2. Bằng SKLM:
Kết quả:
UV 254 Thuốc thử FeCl3
3.3.6. Định lượng:
Kết quả định lượng viên nang chứa cao Diếp cá: áp dụng công thức ở mu ̣c 2.2.3.6.
Sc = 60085198; St = 62727371; Cc = 100 (µg/ml); m = 1,0334g; P = 0,4959g
Hàm lượng trong 1 viên: 249,98 µg Đạt.
3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ:3.4.1. Tiêu chuẩn kỹ thuật: 3.4.1. Tiêu chuẩn kỹ thuật:
Hình 3.14. Kết quả định tính bằng SKLM viên nang chứa cao Diếp cá.
1. YÊU CẦU KỸ THUẬT:
1.1. Công thức pha chế cho một viên nang:
Cao Diếp cá 250mg Tá dược vừa đủ 1 viên
1.2. Nguyên liệu:
Cao Diếp cá Đạt tiêu chuẩn cơ sở Tá dược A Đạt tiêu chuẩn Tá dược B Đạt tiêu chuẩn Magnesi carbonate Đạt tiêu chuẩn cơ sở Talc Đạt tiêu chuẩn USP 27 Povidon K30 Đạt tiêu chuẩn USP 27 Cồn 96% Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
1.3. Chất lượng thành phẩm:
1.3.1. Tính chất: Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng.
1.3.2. Độ đồng đều khối lượng: ± 7,5% so với khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang.
1.3.3. Độ tan rã: không quá 30 phút.
1.3.4. Độ ẩm: không quá 5%.
1.3.5. Định tính: Phải có phản ứng đặc trưng của Diếp cá.
1.3.6. Định lượng: mỗi viên phải chứa quercetin trong giới hạn 218,25 µg đến 266,76 µg tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang.
2. PHƯƠNG PHÁP THỬ:
2.1. Tính chất: kiểm tra bằng cảm quan chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu.
2.2. Độ đồng đều khối lượng: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.3. 2.3. Độ tan rã: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.6.
2.4. Độ ẩm: đo độ ẩm bằng cân sấy ẩm hồng ngoại với các thông số như sau: - Lượng cân: khoảng 3g.
- Nhiệt độ sấy: 105oC.
- Tốc độ độ ẩm tới hạn: 0,01%/phút.
2.5. Định tính:
Cho bột thuốc trong nang vào cối chày và nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột thuốc tương ứng khoảng 0,5g cao Diếp cá hòa tan trong khoảng 15ml cồn 96%, đun nóng nhẹ. Lọc lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm làm các phản ứng.
Nhỏ vào ống nghiệm thứ nhất vài giọt Natri hydroxyd 1% (TT). Dung dịch chuyển sang màu vàng sáng.
Nhỏ vào ống nghiệm thứ hai vài giọt Sắt (III) clorid 1% (TT). Dung dịch chuyển sang màu xanh đen.
Cho dịch chiết vào ống nghiệm thứ 3 đã chứa sẵn một ít bột Magnesi kim loại. Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 1 – 2 ml dung dịch HCl đậm đặc. Dung dịch xuất hiện màu đỏ.
B. Bằng sắc ký lớp mỏng:
Bản mỏng Silicagel F254 (Merck).
Dung môi khai triển: Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1).
Dung dịch chuẩn: cho một ít tinh thể quercetin vào ống nghiệm, thêm vài giọt methanol để hòa tan.
Dung dịch thử: cân một lượng bột thuốc đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 0,5g cao Diếp cá, hòa tan trong 5ml cồn 96%, lọc thu lấy dịch lọc. Thêm vào 5ml dung dịch HCl 10% (TT) rồi đun cách thủy để thủy phân. Lắc dịch đã thủy phân với 10ml
chloroform, lấy dịch chloroform chấm sắc ký.
Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl mỗi dung dịch. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi đi được khoảng 10cm. Làm khô bản mỏng, kiểm tra dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và bằng dung dịch Sắt (III) clorid 1%/ cồn 96% (TT). Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết trùng với sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.
2.6. Định lượng:
Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng.
Pha động: Methanol – dung dịch nước acid phosphoric 0,2% (60:40).
Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 50mg quercetin chuẩn vào trong bình định mức 50ml, hòa tan và pha loãng bằng methanol (TT) đến định mức, trộn đều. Pha
loãng 5ml dung dịch thu được thành 50ml với methanol (TT), trộn đều. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
Dung dịch thử:
Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột thuốc tương ứng với 1g cao Diếp cá, hòa tan trong 10ml cồn 25% (TT), lọc thu lấy dịch lọc, rữa cắn với khoảng 2ml cồn 25% (TT), thêm vào 20ml
chloroform, lắc đều 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân sau đó lắc với 15ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại đến khi chiết kiệt quercetin. Gộp dịch chloroform lắc với 20ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua natri sulfat khan sau đó đem cô đến dịch chloroform đậm đặc.
Dịch Chloroform đậm đặc cho qua cột SPE tự chế (1,0g silica kích thước hạt 40µm – 63µm, chiều dài cột 70mm, đường kính 12mm) để loại tạp. Cho 20ml chloroform qua cột SPE để loại tạp phân cực, tiếp theo cho 40ml hỗn hợp CHCl3: EtOAc – 6:4 để lấy phân đoạn chứa quercetin. Cô phân đoạn chứa quercetin đến cắn.
Hòa tan cắn trong methanol rồi cho vào bình định mức 10ml, bổ sung đủ thể tích, lọc sơ bộ. Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm.
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (25cm x 4,0mm) được nhồi pha tĩnh C (5µm). Nhiệt độ cột: 25oC.
Detector DAD, bước sóng phát hiện 370nm. Tốc độ dòng: 0,8ml/phút.
Thể tích tiêm: 20µl.
Cách tiến hành:
Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký đối với dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của diện tích peak quercetin trong 6 lần tiêm lặp lại nhỏ hơn 2,0%.
Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Tính hàm lượng quercetin có trong một viên nang dựa vào diện tích peak trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng quercetin có trong mẫu chuẩn.
3. ĐÓNG GÓI – GHI NHÃN - BẢO QUẢN:
Đóng gói: Đóng trong chai nhựa có chất hút ẩm, mỗi chai 100 viên hoặc ép vĩ bấm, mỗi vĩ 10 viên.
Nhãn: đúng quy chế.
Bảo quản: Nơi khô mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ không quá 30oC.
3.4.2. Kết quả kiểm nghiệm:
Bảng 3.20. Kết quả kiểm nghiệm viên nang Diếp cá.
Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Kết quả
Tính chất Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng.
Đúng
Độ đồng đều khối lượng Khối lượng trung bình ±7,5% Đạt (0,4949 ± 4,79%)
Độ tan rã Không quá 30 phút Đạt (7,5 phút)
Độ ẩm Không quá 5% Đạt (4,52%)
A. Bằng phản ứng hóa học Dd NaOH 1% Dd FeCl3 1% Mg/HCl đậm đặc B. Bằng SKLM Màu vàng sáng Màu xanh đen Màu đỏ
Dung dịch thử phải cho một vết tương đương về màu sắc và Rf với dung dịch chuẩn.
Đúng Đúng Đúng Đúng
Định lượng Mỗi viên phải chứa quercetin trong giới hạn 218,25 µg đến 266,76 µg tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang.
Đạt
(249,98µg/viên)
Kết luận: Viên nang Diếp cá đạt tiêu chuẩn cơ sở.
Chương IV - BÀN LUẬN
4.1. VỀ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG QUERCETIN TRONG CAO DIẾP CÁ VÀ VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ:
Diếp cá chứa phần lớn các flavonoid có aglycon là quercetin. Vì vậy, dùng quercetin như là chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá là phù hợp.
Mẫu cao Diếp cá và mẫu viên nang chứa cao Diếp cá được xử lý để đảm bảo quá trình thủy phân các flavonoid được xảy ra hoàn toàn, quá trình loại tạp được triệt để, đảm bảo an toàn cho hệ thống HPLC.
Với kết quả thu được sau khi thẩm định, các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính và miền giá trị của phương pháp HPLC cho cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá cho thấy phương
pháp đáp ứng quy trình định lượng và không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của chất khác như tá dược, dung môi hòa tan mẫu,...
4.2. VỀ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC CHO VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ:
Bào chế viên nang thường không quá phức tạp như viên nén, thành phần khối thuốc tương đối đơn giản, không phải dùng nhiều loại tá dược như viên nén. Mặt khác, bào chế viên nén từ dược liệu không cho cảm quan tốt. Viên sau khi nén phải được bao đường hoặc bao phim, đòi hỏi kỹ thuật và thiết bị phức tạp. Vì vậy, đề tài chọn dạng bào chế là viên nang.
Để bào chế viên nang thì yếu tố quan trọng nhất của khối bột thuốc là hàm ẩm và khả năng hút ẩm vì chúng có thể làm hư vỏ nang. Ngoài ra, cần phải chọn tá dược phù hợp sao cho lượng tá dược sử dụng là ít nhất. Bằng các thiết kế nghiên cứu đơn giản của Gauss – Geidell, đề tài đã chọn được tá dược hút ẩm là MgCO3 với hàm lượng là 15%, tá dược độn phù hợp, hàm lượng cao trong khối bột thuốc là 50%.
Để đảm bảo chắc chắn viên nang sau khi bào chế đạt độ đồng đều khối lượng thì khối bột thuốc bào chế được phải có tỷ lệ hạt mịn nhỏ, phân bố kích thước hạt phù hợp và độ trơn chảy tốt. Để thực hiện điều đó, đề tài đã sử dụng povidon K30 làm tá dược dính để giảm tỷ lệ bột mịn, sử dụng talc để khối bột thuốc trơn chảy tốt đồng thời thiết kế lựa chọn công thức có phân bố cỡ hạt phù hợp.