2.2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đốn nhanh bằng cây chỉ thị
Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ của virus, nhƣng đặc biệt hơn là chúng mẫn cảm cao với virus và tạo ra các triệu chứng rất điển hình trên thân, lá, … Các triệu chứng này giúp ta chẩn đốn khá chính xác các bệnh do virus.
Đối với virus, cĩ 2 nhĩm chỉ thị: nhĩm chỉ thị theo bộ phận (necrotic) và nhĩm chỉ thị theo hệ thống (systemic). Nhĩm chỉ thị theo bộ phận là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ cĩ vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà khơng di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Ví dụ nhƣ cây cà độc dƣợc (Datura
stramonium) khi bị nhiễm TMV sẽ xuất hiện những vết đốm chết hình trịn trên mặt lá
thống là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên tồn cây (Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998).
2.2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đốn dựa vào triệu chứng
Triệu chứng bên ngồi: Các triệu chứng phổ biến là đốt cuối ngắn, vàng những lá cuối, mặt dƣới của gân lá trở nên vàng hơn lá già, hoại tử bắt đầu từ chĩp lá, …
Triệu chứng bên trong: Sự thay đổi tế bào và mơ cĩ thể quan sát qua kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Ngƣời ta cịn quan sát những cấu trúc khác nhau do virus sản sinh ra, thƣờng là những thể vùi.
2.2.7.3 Phƣơng pháp chẩn đốn bằng Brix kế
Độ brix đƣợc đánh giá vào giai đoạn mía 10 tháng tuổi bằng Brix kế trên gân chính lá +1 và đƣợc chia thành 4 mức độ nhiễm bệnh khác nhau:
Khơng bị bệnh: khơng cĩ triệu chứng, độ brix nhỏ hơn 7.
Nhiễm nhẹ: độ brix từ 7 đến 14.
Nhiễm trung bình: Nhìn mặt trên và mặt dƣới lá cĩ màu vàng, độ brix lớn hơn 14, phiến lá cĩ màu vàng lan ra từ gân chính.
Nhiễm nặng: tồn bộ phiến lá và gân lá chính cĩ màu vàng, triệu chứng khơ từ cổ lá xuống bẹ lá, tồn bộ cây trong bụi cĩ triệu chứng bệnh, độ brix lớn hơn 14, bụi cĩ thể nhổ lên dễ dàng (Hà Đình Tuấn, 2004).
2.2.7.4 Phƣơng pháp chẩn đốn bằng kính hiển vi huỳnh quang
Những lát cắt tƣơi đƣợc cắt từ gân, bẹ lá và thân bởi dao lam đƣợc làm tiêu bản trên một giọt nƣớc cất hai lần trên lam kính và đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Tồn bộ mơ đƣợc nghiên cứu với sự chuyển từ ánh sáng trắng sang ánh sáng xanh bởi đèn huỳnh quang. Sự kiểm tra huỳnh quang với ánh sáng kích thích màu xanh đƣợc tiến hành thơng qua một kính tách màu nhị sắc ở bƣớc sĩng 510nm và một kính lọc màu vàng chặn lại tại bƣớc sĩng 510nm.
Hình 2.6. Các bĩ mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. (A) Chất huỳnh quang màu vàng xanh (đầu mũi tên) trong mạch libe với triệu chứng vàng gân lá. (B) Cây khơng cĩ triệu chứng các bĩ mạch libe bình thƣờng (J. Vega và cộng sự, 1997).
Kiểm tra những lát cắt từ cây cĩ triệu chứng vàng gân lá bởi phƣơng pháp phát huỳnh quang đã phát hiện ra những bĩ mạch với chất phát huỳnh quang màu vàng xanh ở trong mạch libe (hình 2.6 A). Trong những cây khơng cĩ biểu hiện triệu chứng thì hiếm khi xuất hiện màu huỳnh quang trong mạch libe (hình 2.6 B).
2.2.7.5 Phƣơng pháp chẩn đốn bằng kính hiển vi điện tử
Những lát cắt cực mỏng từ lá, gân hoặc thân mía sau khi sử lý bằng hĩa chất đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử.
Virus đƣợc tìm thấy ở dạng kết tụ vơ định hình trong tế bào chất của tế bào kèm của mạch libe. Trong tế bào kèm, virus chỉ xuất hiện ở tế bào chất khơng thấy ở trong nhân hay các cơ quan tử khác của tế bào chất. Đƣờng kính của hạt virus từ 22 đến 24 nm.
Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía (VP: virus particles, CW: cell wall, N: nucleus, tỷ lệ thƣớc 100nm).
(Nguồn: Vega, 1997)
2.2.7.6 Phƣơng pháp chẩn đốn bằng kỹ thuật DAS-ELISA
Kháng nguyên thu đƣợc (hạt virus tinh sạch) sẽ đƣợc tiêm vào thỏ New Zeland để thu globulin miễn dịch. Kháng thể sau khi sản xuất sẽ đƣợc sử dụng cho DBIA, TBIA, ISEM để phát hiện các mơ bị nhiễm ScYLV (Angel và cộng sự, 2006).
DAS-ELISA đƣợc thực hiện trên kháng nguyên từ lá mía và dịch nƣớc mía cho thấy kháng nguyên từ dịch nƣớc mía cĩ chuẩn độ cao hơn kháng nguyên từ lá mía (R Viswanathan và M Balamuralikrishnan, 2004).
2.2.7.7 Phƣơng pháp chẩn đốn bằng tissue blot immunoassay (TIBA)
Cũng giống nhƣ ELISA, TIBA sử dụng kháng thể chống lại virus. Nhựa từ cây đƣợc chuyển lên một màng nylone hay nitrocellulose và virus đƣợc phát hiện nhờ vào mẫu dị đƣợc đánh dấu. Quy trình này khơng cần nhiều thao tác nhƣ ELISA, nhanh, nhạy, đơn giản (khơng cần dịch chiết của virus), khơng đắt tiền (chỉ cần số
lƣợng trang thiết bị tối thiểu), thích hợp cho khảo sát 1000 - 2000 mẫu trên ngày. Kit cũng đã sẵn cĩ cho nhiều virus.
Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới)
(Comstock và Gilbert)
Sự nhiễm ScYLV đƣợc xác định bằng một kháng thể đặc hiệu cho ScYLV. Lá đƣợc cắt khỏi cây và bản lá đƣợc cắt khỏi gân lá trong một thời gian ngắn. Vị trí gốc của gân lá đƣợc cắt bằng dao mỏng. Miếng cắt gân lá đƣợc cố định trên màng nitrocellulose. Sau đĩ màng đƣợc rửa với huyết thanh sử dụng kháng thể đặc hiệu cho ScYLV đƣợc tạo ra bởi B. E. Lockhart, Đại học Minnesota (Minneapolis) (theo Comstock và Miller (2003)). Sau đĩ đƣợc phủ bởi cơ chất tạo màu. Kính hiển vi ba chiều đƣợc dùng để kiểm tra vết lá in. Vì ScYLV đƣợc xác định ở trong mạch libe nên mẫu dƣơng tính cho sự hiện diện của virus khi những bĩ mạch libe trong vết lá in cĩ màu xanh (Comstock và Miller, 2003) (hình 2.8 và 2.9).
Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh của BYDV-PAV. Kết tủa xuất hiện ở mạch libe của gân lá (A và B), lá (C),
thân (D). Tỷ lệ thƣớc 200µm. (Nguồn: Vega, 1997)
2.2.7.8 Chẩn đốn ScYLV bằng kỹ thuật Immunoblotting (western blotting)
Sau khi điện di protein trên SDS-PAGE, polypeptides đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose để thực hiện Immunoblotting (western blotting). Màng đƣợc ngâm 2 phút trong 2% Tween 20 (v/v) và ủ qua đêm ở 40C với kháng thể sơ cấp (tồn bộ huyết thanh) đƣợc pha lỗng với tỉ lệ 1:5000 trong TTBS chứa 1% gelatin. Những band protein đƣợc phát hiện dựa vào 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate và nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT). Hạt virus ScYLV chứa protein 27 kDa, là một polypeptide đƣợc xác định bằng cách nhuộm với Coomassie blue (hình 2.11A). Protein 58, 27 và 17 kDA (6 band) đƣợc xác định bằng western blotting với kháng huyết thanh ScYLV (hình 2.11,lane1).
Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV
2.2.7.9 Real -Time PCR
Sử dụng phân tử beacon (Tyagi và Kramer, 1996; Eun và Wong, 2000) trong chẩn đốn virus cho phép phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu hơn các kỹ thuật khác. Kết hợp kỹ thuật phân tử beacon với sự khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleotide (NASBA: nucleic acid sequence-based amplification, Kievits và cộng sự, 1991) cho phép đồng thời khuếch đại và phát hiện RNA của virus trong một tube kín, đƣợc gọi là AmpliDet RNA (Leone và cộng sự, 1998). NASBA là phƣơng pháp khuếch đại RNA đích của virus trong điều kiện đẳng nhiệt ở 410C sử dụng hai oligonucleotide primer đặc hiệu và enzyme AMV-reverse transcriptase (AMV-RT), RNase H và T7-RNA polymerase. Gần đây, AmpliDet RNA đã đƣợc sử dụng để xác định một số virus thực vật (Klerks và cộng sự, 2001; Leone và cộng sự, 1998; Szemes và cộng sự, 2002). AmpliDet RNA cĩ độ nhạy cao và ổn định cho việc phát hiện những virus ở trong mơ cây phức tạp nhƣ vỏ, chồi, củ và quả. Hơn nữa, AmpliDet RNA phát hiện đƣợc đồng thời nhiều virus riêng biệt trong cùng một tube (Klerks và cộng sự, 2001; Szemes và cộng sự, 2002).
Hình 2.11. Phân tử Beacon
(Nguồn: http://www.molecular-beacons.org)
Phân tử beacon MB ScYLV đƣợc thiết kế để mang trình tự 6 nucleotide tự bổ sung với nhau ở đầu 5’ và đầu 3’. Trình tự 21 nucleoitde bổ sung cho sản phẩm NASBA đặc hiệu cho ScYLV đƣợc chọn để lai với vùng tƣơng tự nhƣ biotinylated probe BIO ScYLV. Phân tử beacon đƣợc kết hợp với 6-carboxyfluorescein (FAM; bị kích thích ở bƣớc sĩng 494 nm, phát sáng ở bƣớc sĩng 530 nm) và quencher 4-[4 -
dimethylaminophenylazo]-benzoic acid (DABCYL) riêng biệt ở đầu 5’ và 3’. Đầu 6 nucleotide cấu trúc sợi đơi ở 410C sẽ kìm hãm sự phát quang khi khơng cĩ sự bắt cặp với trình tự đích. Khi cĩ mặt gene đích probe sẽ bắt cặp với gene đích đồng thời với sự phát huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đƣợc đo ở bƣớc sĩng 530nm sau mỗi 2 phút.
Phƣơng pháp này cĩ độ nhạy cao với ScYLV, cĩ thể phát hiện ScYLV ở mật độ rất nhỏ 10fg (femtogram, 1fg = 10-15
g). Phƣơng pháp cho phép phát hiện ScYLV sau khi pha lỗng mẫu 1000 lần (Gonçalves và cộng sự, 2002).
2.2.7.10 Chẩn đốn ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR
RT-PCR đƣợc thực hiện trên dịch trích mơ bị nhiễm ScYLV với cặp primer Lu1 và Lu4 đặc hiệu cho nhĩm virus luteovirus (Irey và cộng sự, 1997). Cặp primer Lu1 và Lu4 tạo ra sản phẩm cĩ kích thƣớc 530bp đặc hiệu cho gene mã hĩa protein vỏ của virus (Robertson và cộng sự, 1991 (trích bởi Schenck, 2001)). Những primer này đƣợc sử dụng để tách trình tự acid nucleotide của ScYLV mà nĩ đƣợc chứng minh rằng cĩ khoảng 40% tƣơng đồng với trình tự PAV của kiểu huyết thanh BYDV. Từ trình tự của ScYLV đƣợc phân lập từ Florida, một cặp primer khác đã đƣợc tạo ra (YLS111 và YLS462), nĩ đặc hiệu cho ScYLV (Irey và cộng sự, 1997). Primer này khuếch đại gene mã hĩa cho protein vỏ của ScYLV. Sản phẩm khuếch đại cĩ kích thƣớc 352bp. Ngày nay cặp primer này đƣợc sử dụng để phát hiện ScYLV ở các nơi nhƣ Brazil, Colombia, Taiwan, Mauritius và Mexico Florida, Hawaii, (Irey, thơng tin cá nhân).
Ngồi ra các cặp primer khác khuếch đại gene mã hĩa protein vỏ cũng đƣợc sử dụng để phát hiện ScYLV nhƣ các cặp primer:
RT-PCR sense primer – P1f GCT AAC CGC TCA CGA AGG AAT GT
(3660–3882bp).
RT-PCR antisense primer – P2r GAA GGG GGC CGG GAA GAC T (4091–4109 bp).
RT-PCR sense primer – P3f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG TGG A (3997–4021bp).
RT-PCR antisense primer – P4r GAA TTG TCC TGC TAG GCT CGA (4179–4199bp).
NASBA sense primer – N2f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG TGG A (3997–4022bp) (Gonçalves và cộng sự, 2002).