3.6.3.1 Qui trình tổng hợp cDNA
Nƣớc khơng chứa nuclease 10 μl
5X iScript reaction mix 4 μl
iScript reversetranscriptase 1 μl
Mẫu RNA 5 μl
Tổng thể tích phản ứng 20 μl
Chu trình nhiệt của phản ứng:
250C /5 phút, 420C /30 phút, 850C /5 phút – 1 chu kỳ. Giữ ở 40 C. 3.6.3.2 Qui trình PCR MgCl2 (50 mM) 2,00 μl 10X PCR buffer 5,00 μl dNTP (10mM) 1 μl H2O 39,50 μl cDNA mẫu 1 μl
itaq DNA polymerase (5 U/μl) 0,25 μl (Biorad)
YLS 462 primer (30 μM stock) 0,5 μl
YLS 111 primer (30 μM stock) 0,5 μl
Tổng thể tích 50,00 μl Chu trình nhiệt 940C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /20 phút – 1 chu kỳ. 940C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /2 phút - 40 chu kỳ. 720C 10 phút - 1 chu kỳ. 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu
PHẦN 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLVCác biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV là vàng ở gân lá cả mặt trên và mặt dƣới (hình 4.1).
Hình.4.1. Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá (dƣới) và lá khơng biểu hiện triệu chứng vàng gân lá (trên). (A) mặt trên của lá, (B) mặt dƣới của lá.
(Hình chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An ngày 19/03/2006).
Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3
(Hình chụp tại xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai ngày 25/03/2006).
Triệu chứng vàng gân lá xuất hiện bắt đầu từ lá thứ 3 ( hình 4.2) và những lá già hơn trên tồn cây và xuất hiện những vết hoại tử trên lá (Hình 4.3).
Triệu chứng này biểu hiện làm cho tồn bộ cánh đồng chuyển thành màu vàng (hình 4.4).
Hình 4.3. (A) cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. (B) cây khơng cĩ triệu chứng vàng gân lá.
(Hình chụp tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú ngày 14/03/2006).
Hình 4.4. Cánh đồng cĩ triệu chứng vàng gân lá (A). Cánh đồng khỏe mạnh (B)
(Hình (A) chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây ngày 19/03/2006, hình (B) chụp tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú ngày 14/03/2006).
A B
Đây là những triệu chứng đặc trƣng gây ra bởi ScYLV. Các triệu chứng này khơng giống với biểu hiện của sự thiếu dinh dƣỡng. Triệu chứng này giống nhau ở tất cả mọi nơi (Schenck, 2001).
Các triệu chứng trên là cơ sở ban đầu giúp chẩn đốn tình trạng nhiễm virus trên đồng ruộng.
4.2 Kết quả chẩn đốn dựa vào triệu chứng
4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng
Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng đƣợc trình bày ở Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng vàng gân lá theo các giai đoạn sinh trƣởng cĩ sự khác biệt lớn về phƣơng diện thống kê (P<<0.05). Tỷ lệ nhiễm bệnh gia tăng theo độ tuổi phát triển của cây. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004) cho rằng bệnh vàng gân lá phát sinh – phát triển tăng theo các giai đoạn sinh trƣởng của cây mía và tỷ lệ này tăng nhanh sau giai đoạn cây đẻ nhánh.
Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng
Giai đoạn sinh
trƣởng triệu chứng (cây) Khơng cĩ Cĩ triệu chứng (cây) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%)
Đẻ nhánh 51 25 32,89
Đầu vƣơn lĩng 26 14 35,00
Giữa vƣơn lĩng 4 8 66,67
Thu hoạch 9 31 77,50
Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Đẻ nhánh Đầu vươn lĩng Giữa vươn lĩng Thu hoạch
Tuổi Tỷ lệ (%)
Trong giai đoạn đẻ nhánh tỷ lệ nhiễm chỉ 32,89% nhƣng tới giai đoạn thu hoạch tỷ lệ này tăng lên tới 77,5%. Tuy nhiên, điều này khơng chứng tỏ rằng tỷ lệ nhiễm virus của cây ở giai đoạn đẻ nhánh là thấp. Trong quá trình điều tra cho thấy mía thƣờng đƣợc tái sinh từ gốc của vụ trƣớc. Do đĩ, virus sẽ đƣợc truyền từ gốc mía sang cây con. Tỷ lệ nhiễm bệnh trong giai đoạn đẻ nhánh thấp cĩ thể là do giai đoạn này sự biểu hiện triệu chứng thấp.
Kết quả chúng tơi thu đƣợc phù hợp với kết quả của Comstock và cộng sự (2003), Parmessur và cộng sự (2002) và Schenck (2001) cho rằng triệu chứng vàng gân lá biểu hiện rõ ràng và nhiều nhất ở giai đoạn cây trƣởng thành.
4.2.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng
Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng đƣợc trình bày ở Bảng 4.1 và biểu đồ 4.2. Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng vàng gân lá ở các vùng cĩ sự khác biệt lớn (P<<0,05). Qua Bảng 4.2 và biểu đồ 4.2 chúng tơi nhận thấy tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá cao nhất ở cánh đồng Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An (77,5%). Sau đĩ là Tân An, Thủ Dầu Một (75%), An Phú (58,33%), Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai (35,56%), tập đồn giống gốc tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú (29,03%), giống mới nhập từ Thái Lan (25,00%).
Giống Thái Lan mới nhập cĩ biểu hiện triệu chứng thấp là do giống này đã đƣợc kiểm dịch nghiêm ngặt và đƣợc trồng xung quanh nhà kính, cách biệt với các giống khác và đƣợc chăm sĩc tốt. Tập đồn giống gốc tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú biểu hiện triệu chứng thấp do giống ở đây đƣợc chăm sĩc tốt. Mặt khác, mía tại đây đang trong giai đoạn đẻ nhánh nên triệu chứng cũng biểu hiện thấp.
Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng
Nguồn gốc triệu chứng (cây) Khơng cĩ chứng (cây) Cĩ triệu Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Thái Lan 21 7 25,00 An Phú 5 7 58,33 Giống gốc 22 9 29,03 Tân An 4 8 66,67 Mỹ Thạnh 9 31 77,50 Phú Lý 29 16 35,56
Biểu đồ 4.2.Tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các địa phƣơng 25.00 58.33 29.03 66.67 77.50 35.56 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 Thái Lan An Phú Giống gốc Tân An Mỹ Thạnh Phú Lý Vùng Tỷ lệ (%)
Ở Phú Lý tỷ lệ cĩ triệu chứng vàng gân lá cao hơn ở giống Thái Lan và tập đồn giống gốc tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú mặc dù chúng cùng giai đoạn sinh trƣởng. Điều này cĩ thể giải thích là do ở Phú Lý điều kiện chăm sĩc khơng tốt. Hơn nữa, mía ở đây đƣợc tái sinh từ gốc của các vụ trƣớc nên nguy cơ truyền virus từ gốc sang cây con là rất cao. Điều này cũng làm cho tỷ lệ vàng gân lá ở đây cao hơn. Mặt khác, đất ở đây khơ cứng cĩ thể làm cây bị stress nên tỷ lệ vàng gân lá biểu hiện cao.
Tỷ lệ triệu chứng vàng gân lá ở các mẫu từ Mỹ Thạnh Tây cao nhất là do mía ở đây đang trong giai đoạn thu hoạch. Đây là giai đoạn mà triệu chứng vàng gân lá biểu hiện cao nhất.
Tỷ lệ vàng gân lá ở An Phú và Tân An cao cũng đƣợc giải thích tƣơng tự ở Mỹ Thạnh Tây.
Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú là nơi tạo giống và cung cấp giống cho nhiều vùng sản xuất mía đƣờng khác trong cả nƣớc. Tuy nhiên, tập đồn giống gốc tại đây đã xuất hiện triệu chứng vàng gân lá điều đĩ đồng nghĩa với việc đây cĩ thể là nơi truyền bệnh sang các vùng khác qua con đƣờng giống.
Qua điều tra cho thấy giống mới nhập từ Thái Lan mặc dù đã qua kiểm sốt chặt chẽ song vẫn cĩ sự hiện diện của triệu chứng vàng gân lá. Ở đây chúng tơi khơng thể khẳng định triệu chứng vàng gân lá trên tập đồn giống này là do nhiễm virus
trƣớc khi nhập nội hay sau khi trồng tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú bởi vì giống này đƣợc nhập khơng cĩ sự kiểm sốt ScYLV.
4.2.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống
Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống đƣợc trình bày ở Bảng 4.3 và biểu đồ 4.3.
Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng giữa các giống cĩ sự khác biệt lớn (P<<0,05). Tồn
bộ mẫu lấy từ giống R570 đƣợc nhập từ Pháp và giống Việt Nam gốc Mỹ DLM 24 đều
cĩ triệu chứng vàng gân lá (100%). Trong khi đĩ mẫu lấy từ giống RB 72454 nhập từ
Braxin thì khơng cĩ biểu hiện triệu chứng. Ngồi ra các giống khác đều cĩ biểu hiện
triệu chứng vàng gân lá.
Trên các giống R570 và DLM 24 tỷ lệ nhiễm cao cĩ thể là do các giống này mẫn cảm với ScYLV.
Giống Thái Lan tỷ lệ nhiễm là 42,55%, trong số này tỷ lệ nhiễm rơi vào các giống nhập năm 1992, giống này đã đƣợc sản xuất đại trà trên các cánh đồng mía thƣơng mại ở nƣớc ta. Trong các giống mới nhập nội tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với giống đang sản xuất đại trà (Bảng 4.2).
Bảng 4.3.Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống
Nguồn gốc Khơng cĩ triệu chứng (cây) Cĩ triệu chứng (cây) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Thái Lan 27 20 42,55 Ấn Độ 1 1 50,00 Việt Nam 6 22 78,57 Braxin 1 0 0,00 Cuba 35 12 25,53 Pháp 0 2 100,00 Australia 4 0 0,00 Hawaii 9 6 40,00 gốc Mỹ 0 1 100,00 Đài Loan 8 13 61,90
Biểu đồ 4.3Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống 42,55 50,00 78,57 0,00 25,53 100,00 0,00 40,00 100,00 61,90 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 T há i L an Ấ n Đ ộ Vi ệt N am B ra xin C uba Pháp A us tr alia H aw aii g ốc M ỹ Đ ài L oa n Nguồn gốc Tỷ lệ (%)
Trên giống Comus nhập từ Australia chúng tơi khơng ghi nhận thấy triệu chứng vàng gân lá. Kết quả này phù hợp với kết quả trong nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004). Cĩ thể là do trên giống này cĩ khả năng kháng lại ScYLV nên mặc dù giống này đƣợc trồng cạnh cánh đồng giống R570 (100% vàng gân lá) mà giống này vẫn khơng cĩ biểu hiện triệu chứng.
4.3 Quan sát mạch dẫn bằng kính hiển vi huỳnh quang
Chúng tơi tiến hành kiểm tra trên 150 mẫu gân lá bằng kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả cho thấy chỉ những mẫu nào cĩ biểu hiện triệu chứng của bệnh vàng gân lá thì bĩ mạch libe mới cĩ khả năng tự phát huỳnh quang khi bị kích thích bởi ánh sáng xanh ở bƣớc sĩng 510nm (Hình 4.5). Sự tự phát huỳnh quang của mạch libe cĩ liên quan đến triệu chứng vàng gân lá (P = 0,379>0,05).
Đối với những mẫu khơng cĩ triệu chứng thì bĩ mạch libe khơng cĩ sự tự phát huỳnh quang và khơng cĩ khác biệt khi quan sát bởi kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi quang học (Hình 4.5 và 4.6).
Những hợp chất phenol cĩ vai trị quan trọng trong quá trình tiêu diệt ký sinh gây bệnh của cây trồng. Phenol cĩ vai trị tham gia vào quá trình suberin và lignin hĩa để hình thành các mơ cơ giới là một trong những nhân tố cản trở sự phát triển của ký sinh (Trần Kim Đồng và cộng sự, 1991).
Sự phát huỳnh quang trên các bĩ mạch libe cĩ thể là do sự tích tụ các hợp chất phenol trong các bĩ mạch khi bị virus tấn cơng. Sự phát huỳnh quang trong những bĩ
mạch libe cũng chứng tỏ rằng cĩ sự rối loạn trong quá trình biến dƣỡng dẫn tới sự tích lũy hợp chất phenol (Vega, 1997). Tuy nhiên, hợp chất phenol bao gồm lignan, lignin, tanin, … để khẳng định hợp chất phenol nào cĩ khả năng phát huỳnh quang thì cần phải nghiên cứu thêm.
Đối với những lá cĩ phản ứng chết sự tích tụ hợp chất phenol vẫn xảy ra. Tuy nhiên, khi quan sát chúng dƣới kính hiển vi huỳnh quang chúng tơi nhận thấy xung quanh bĩ mạch và vách các tế bào đều phát huỳnh quang nhƣng trong bĩ mạch libe khơng cĩ sự phát huỳnh quang (Hình 4.7)..
Hình 4.5 Các bĩ mạch của gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang
B
A
(A) Cây mía cĩ triệu chứng vàng gân lá bĩ mạch libe cĩ chất phát huỳnh quang màu vàng xanh. (B) Cây mía bình thƣờng mạch libe bình thƣờng. Độ phĩng đại 200X. (Hình chụp tại
Trung tâm Cơng nghệ và Quản lý Tài nguyên và Mơi trƣờng ngày 01/08/2006).
Hình 4.6. Các bĩ mạch gân lá đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học (100X)
(Hình chụp tại Trung tâm Cơng nghệ và Quản lý Tài nguyên và Mơi trƣờng ngày 01/08/2006).
Hình 4.7. Sự phát huỳnh quang của tế bào do cĩ phản ứng chết (200X)
(Hình chụp tại Trung tâm Cơng nghệ và Quản lý Tài nguyên và Mơi trƣờng ngày 01/08/2006).
Sự tự phát huỳnh quang cũng xảy ra tƣơng tự đối với các virus khác chỉ tồn tại trong mạch libe nhƣ luteovirus, closterovirus và mycoplasma (Vega, 1997). Sự tự phát huỳnh quang xảy ra khơng giúp chúng tơi khẳng định chính xác rằng cĩ sự hiện diện
của ScYLV, nhƣng kết quả này bƣớc đầu giúp chẩn đốn cĩ sự hiện diện của ScYLV, giúp chúng tơi khẳng định đƣợc các mẫu trên cĩ sự tấn cơng của virus. Để khẳng định chính xác sự hiện diện của ScYLV cần cĩ những chẩn đốn về mặt phân tử bằng các kỹ thuật cơng nghệ sinh học nhƣ RT-PCR, ELISA, kính hiển vi điện tử, …
Cĩ thể sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để chẩn đốn sự tấn cơng của ScYLV.
4.4 Kết quả RT-PCR dựa theo qui trình của M. Irey
Chúng tơi tiến hành thay đổi qui trình do M. Irey cung cấp cho phù hợp với điều kiện của phịng thí nghiệm. Kết quả thu đƣợc ở Hình 4.8 cho thấy khi thực hiện theo qui trình chỉnh sửa chúng tơi vẫn thu đƣợc sản phẩm mong muốn (352 bp) và đây là sản phẩm duy nhất. Điều này cho thấy qui trình phản ứng RT-PCR do chúng tơi chỉnh sửa cĩ thể sử dụng để phát hiện ScYLV.
Hai primer YLS111 và YLS462 đƣợc thiết kế bởi M. Irey để khuếch đại protein vỏ của virus vàng gân lá (ScYLV) khơng những cho phép phát hiện ScYLV ở các nƣớc khác (Florida, Hawaii, Brazil, Colombia, Taiwan, Mauritius và Mexico) mà cịn cĩ thể phát hiện đƣợc ScYLV xuất hiện tại Việt Nam.
Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
(M: thang chuẩn kích thƣớc1kb, 1: sản phẩm PCR).
4.5 Kết Quả RT-PCR
Sau khi ổn định qui trình cho phù hợp với phịng thí nghiệm chúng tơi tiến hành kiển tra đối với 9 mẫu đại diện. Kết quả ở Hình 4.9 cho thấy cĩ 4 mẫu đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật RT-PCR cho kết quả dƣơng tính với cặp mồi YLS111 và YLS462.
Các giống K84-200, ROC16, R570, DLM24 đều cho kết quả RT-PCR dƣơng tính. Đồng thời các mẫu này cũng đều cĩ biểu hiện rõ ràng của bệnh vàng gân lá do ScYLV. Các giống Comus, ROC26, C2217, Ja6420, RB72454 khơng cĩ biểu hiện triệu chứng vàng gân lá và âm tính với phản ứng RT-PCR. Điều này chứng tỏ rằng các
352bp M 1
triệu chứng vàng gân lá đã nêu ở mục 4.1 là các triệu chứng đặc trƣng cho bệnh vàng gân lá do ScYLV gây ra.
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
(Giếng 1: K84-200; giếng 2: R570; giếng 3: Comus; giếng 4: RB72454; giếng 5: ROC16; giếng 6: ROC26; giếng 7: C2217; giếng 8: DLM24; giếng 9: Ja6420; M: thang chuẩn kích
thƣớc 1kb).
Các giống âm tính cĩ thể mang đặc tính kháng với ScYLV hoặc cĩ thể là chƣa nhiễm với ScYLV tại thời điểm đƣợc kiểm tra. Khả năng các giống này chƣa nhiễm là rất thấp vì các giống này đƣợc trồng cạnh các giống đang nhiễm nên chúng dễ dàng bị nhiễm. Song khi đƣợc kiểm tra kết quả đều âm tính với các mẫu này. Điều này cho thấy cĩ thể giả thiết các giống này mang đặc tính kháng là nhiều hơn.
Kết quả RT-PCR này cũng là một trong những bằng chứng đầu tiên về mặt phân tử chứng tỏ ScYLV đã hiện diện tại Việt Nam.
352 bp 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luậnTỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo giai đoạn sinh trƣởng:
Đẻ nhánh 32,89%
Đầu vƣơn lĩng 35,00%
Giữa vƣơn lĩng 66,67%
Thu hoạch 77,50%
Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo nguồn gốc giống:
Thái Lan 42,55% Ấn Độ 50,00% Việt Nam 78,57% Braxin 0,00% Cuba 25,53% Pháp 100,00% Australia 0,00% Hawaii 40,00% Việt Nam gốc Mỹ 100,00% Đài Loan 61,90%
Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng:
Giống mới nhập từ Thái Lan 25,00%
An Phú 58,33%
Tập đồn giống gốc 29,03%
Tân An 66,67%
Mỹ Thạnh 77,50%
Phú Lý 35,56%
Kính hiển vi huỳnh quang cĩ thể phát hiện những bĩ mạch libe bị tấn cơng bởi virus khi chúng bị kích thích bởi ánh sáng xanh (blue) ở bƣớc sĩng 510nm. Cĩ thể sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để chẩn đốn sự nhiễm của virus.
Qui trình RT-PCR chúng tơi thực hiện là qui trình cĩ thể đƣợc sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của virus ScYLV.
Kết quả RT-PCR cho thấy các giống K84-200, ROC16, R570, DLM24 đều nhiễm với ScYLV. Các giống Comus, ROC26, C2217, Ja6420, RB72454 khơng phát hiện cĩ nhiễm virus. Đây là bằng chứng đầu tiên về mặt phân tử chứng tỏ đã cĩ sự hiện diện tại Việt Nam.
5.2 Đề nghị
Đánh giá sự hiện diện của ScYLV ở diện rộng hơn bằng các kỹ thuật RT-PCR
TBIA hoặc ELISA.
Áp dụng qui trình RT-PCR chúng tơi thực hiện để chẩn đốn ScYLV.
