2.2.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae Nghành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Euphorbiale Họ: Euphorbiacea Chi: Jatropha Loài: curcas
Jatropha là tên bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp: iatros (bác sĩ) và trophe (thục phẩm) ngụ ý dƣợc tính của cây. Theo nhƣ Correll và Correll (1982) curcas là tên của cây dầu mè tại vùng Malabar, Ấn Độ.
Tên bản xứ của cây dầu mè ở một số nƣớc:( Heller, 1996). Physic nut, purging nut (Anh)
Pignon d’Inde (Pháp) Purgeernoot (Hà Lan) Purgiernu, Brechnu (Đức) Purgueira (Bố Đào Nha) Fafiola d’India (Ý)
Dand barri, habel meluk arand (Hindi) Kadam (Nepal)
Yu-lu-tzu (Trung Quốc) Sabudam (Thái Lan)
Túbang-bákod (Philippine) Jarak dudeg (Indonesia) Bagani (Cô te d’Ivoire) Kpoti (Togo) Tabanani (Senegal) Mupuluka (Angola) Butuke (Nigeria) Makaen (Tanzania) Pinoncillo (Mexico)
Coquillo, tempate (Costa Rica) Tartago (Puerto Rico)
Ở Việt Nam cây đƣợc gọi là cây dầu mè hay cây cọc rào (vì thƣờng đƣợc trồng làm rào dậu).
2.2.2. Đặc điểm sinh học 2.2.2.1. Mô tả
Cây dầu mè là cây bụi gỗ mềm, thân thẳng cao trung bình 6m với tán rộng. Cành non mập và mọng nƣớc, nhựa cây có màu trắng sữa hay màu vàng nhạt, lá rụng sớm, mọc dày ở phần ngọn. Lá có hình ovan, hoặc hình trái tim, có lá chẻ thùy
3 đến 5 thùy. Lá dài 6 – 40cm, rộng 6 – 35cm, cuống dài 2,5 – 7,5cm. Hoa thƣờng nở vào tháng 4 – 5 tạo thành nhiều chùm có màu vàng nhạt, hình chuông. Hoa đực có 10 nhị trong đó 5 nhị dính vào phần chân đế, 5 nhị kết lại thành bó. Hoa cái rời rạc với bầu nhuỵ hình elip, chia làm 3 ô, với 3 núm nhuỵ phân nhánh. Quả có dạng nang, kích thƣớc 2,5 – 4cm về chiều ngang và đƣờng kính. Quả chia thành 3 ngăn, hạt nằm trong các ngăn này. Hạt cây thuôn màu đen kích thƣớc 2 x 1cm.
Hình 2.2: Lá và hoa cây dầu mè
Hình 2.3: Hoa, quả và hạt cây dầu mè 2.2.2.2. Sinh thái
Cây dầu mè có thể phát triển trong các điều kiện khí hậu khô cằn. Điều kiện thích hợp nhất cho cây phát triển là mƣa ít (200mm) nhƣng cây vẫn có thể sống đƣợc ở nơi có lƣợng mƣa cao lên đến 1200mm. Khi gặp hạn hán, cây thích ứng bằng cách rụng hầu hết lá để làm giảm sự thoát hơi nƣớc. Nhiệt độ thích hợp cho cây là 18 – 28,5oC. Điều kiện để hạt nẩy mầm là khí hậu nóng ẩm. Hoa nở trong mùa mƣa và tạo quả trong mùa đông.
Có nhiều bằng chứng cho thấy cây dầu mè có nguồn gốc từ Mexicô và Trung Mỹ, nhƣng hiện nay cây đƣợc tìm thấy ở hầu hết các nƣớc có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Brazil, Honduras, Fiji, Ấn Độ, Jamaica, Panama, Puerto Rico và Salvador.
Cây dầu mè đã có mặt ở Việt Nam từ trƣớc thế kỷ XIV.Cho đến nay cây đã đƣợc trồng rải rác ở nhiều địa phƣơng: Đức Trọng, Bắc Bình, Lạng Sơn, Hàm Thuận Bắc, Hàm Thuận Nam, Ninh Sơn, Thanh Hoá, Lào Cai, Đồng Nai, thành phố Hồ Chí Minh …
2.2.3. Công dụng 2.2.3.1. Nhựa mủ
Nhựa cây dầu mè có chứa các alkaloid nhƣ jatrophine, jatropham, jatrophone và curcain là những chất có tính kháng bệnh ung thƣ. Lá có chứa apigenin, vitexin và isovitexin. Ngoài ra trong lá và cành non còn chứa amyrin, stigmosterol và stigmastenes là những chất có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống dị ứng và ôxi hóa. Chất béo có trong hạt cây giàu palmitic, oleic acid và linoleic acid. Hạt cây có tính độc là do thành phần alkaloid curcin của nó. Nhựa cây đƣợc dùng để trị các bệnh ngoài da nhƣ u nhọt, hắc lào, xuất huyết da. Cành non có tác dụng làm sạch răng miệng(NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006).
2.2.3.2. Lá, vỏ và rễ cây
Lá cây đƣợc chú ý với khả năng kích thích tạo sữa, gây xung huyết da và kháng kí sinh trùng. Lá đƣợc sử dụng để chống ghẻ, thấp khớp, tê liệt, u xơ.
Rễ cây có tác dụng tẩy giun sán, chữa rắn cắn.
Vỏ cây dùng để thuốc cá, và dùng điều trị các vết thƣơng ngoài da.
Nƣớc sắc của vỏ và rễ cây dùng điều trị thấp khớp, bệnh hủi, chứng khó tiêu và tiêu chảy (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006).
2.2.3.3. Hạt và dầu
Hạt cây là loại thuốc trị bệnh phù, bệnh gút (gout), chứng liệt và các bệnh về da. Dầu cây dầu mè có tính tẩy rửa.
2.2.3.4. Dầu mè và nguyên liệu sinh học
Ngoài các tác dụng trị bệnh kể trên, cây dầu mè đƣợc sự chú ý đặc biệt bởi nó là nguồn nguyên liệu sinh học (biofuel). Hạt của cây có độ ẩm (6.62%), protein (18.2%), chất béo (38%), carbohydrate (17.3%), sợi (15.5%) và tro (4.5%). Dầu chiếm 35 – 40% hạt và 50 – 60% nhân hạt. Trong dầu chứa 21% các acid béo không bão hòa. Hạt đƣợc xay và ép lấy dầu hoặc dầu đƣợc tách bằng các dung môi. Tên thƣơng mại của loại dầu này là Jatropha. Dầu sau khi lọc đƣợc sử dụng ngay nhƣ là nguồn nguyên liệu sinh học ở dạng bổ sung, dầu Jatropha có thể trộn với dầu thƣờng với tỉ lệ lên đến 20%. Đây là nguồn năng lƣợng mới an toàn, chi phí thấp và là nguồn năng lƣợng tái sinh đƣợc, hứa hẹn sẽ là nguồn năng lƣợng thay thế cho thủy điện, dầu diessel, dầu lửa, khí hóa lỏng (LPG), than, củi …. Nguồn năng lƣợng này sẽ giúp các nƣớc cắt giảm một khoản tiền cho năng lƣợng và phần nào xóa đi sự mất cân bằng về sử dụng năng lƣợng giữa các vùng. Dầu Jatropha có thể hoàn toàn thay thế cho dầu lửa để sƣởi ấm và nấu ăn. Ƣu điểm là khói từ dầu Jatropha không có mùi và không cay nhƣ khói dầu hỏa và không để lại mùi cho thức ăn sau khi nấu (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006).
Việt Nam phải chi khoảng 2 tỉ 410 triệu đô la một năm để nhập khẩu các sản phẩm dầu (năm 2003) và ngày càng tăng theo các năm. Đây là khoản chi rất lớn của ngân sách quốc gia, có ảnh hƣởng đến toàn bộ nền kinh tế. Trong tƣơng lai dầu Jatropha sẽ thay thế dầu diesel bởi nó có những đặc tính lý hóa tƣơng tự nhƣ dầu diesel, các động cơ chạy bằng dầu diesel thƣờng khi chuyển sang sử dụng dầu Jatropha cũng không phải thay đổi nhiều về cấu trúc động cơ.
2.2.3.4.1. Hiệu quả kinh tế của dầu Jatropha
Bảng 2.1: Năng suất dầu của cây dầu mè
Tuổi cây (năm) Năng suất dầu (kg/ha)
1 250 2 1000 3 2500 4 5000 5 8000 6 trở lên 10000
Nguồn: NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006
Nhƣ vậy với 1 ha cây dầu mè 6 năm tuổi hằng năm có thể thu đƣợc 10 tấn dầu. Hiện nay giá dầu Jatropha đƣợc bán trên thị trƣờng thế giới với giá khoảng 320 USD/ tấn (Trích từ trang web www.bulkoil.com ngày 7/8/2007).
2.2.3.4.2. Dầu Jatropha so với các loại dầu thực vật khác
Trên thế giới hàng năm sản xuất khoảng 110 tỉ tấn dầu thực vật, 70% trong số đó đƣợc sản xuất từ 4 loại cây sau: đỗ tƣơng (26%), dầu cọ (18%), hƣớng dƣơng (13%), cải dầu (12%). [Internet 1]
Hình 2.4: Các cây sản xuất dầu thực vật
Cây dầu mè so với những cây trên là một cây còn khá mới mẻ, chƣa đƣợc biết nhiều đến. Nhƣng nếu tính về phƣơng diện sản xuất dầu sinh học thì cây dầu mè cho hiệu quả kinh tế lớn hơn rất nhiều bởi cây dầu mè là cây lâu năm có thể tạo quả trong nhiều thâp niên, cây có thể phát triển mà không cần phải chăm sóc nhiều trên những vùng đất khô cằn.
2.2.4. Nhân giống
Những nghiên cứu về nhân giống cây dầu mè trên thế giới và ở Việt Nam còn rất hạn chế. Cho đến nay phƣơng pháp nhân giống cây dầu mè chủ yếu vẫn theo lối cổ truyền là giâm cành và gieo hạt. Các phƣơng pháp nhân giống hiện đại áp dụng trên cây dầu mè mới chỉ mới phát triển trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây.
2.2.4.1. Phƣơng pháp nhân giống cổ truyền
Ở Nam Phi, ngƣời dân trồng cây dầu mè làm rào dậu hoặc trồng cây để chống xói mòn và bảo vệ đất thƣờng sử dụng phƣơng pháp giâm cành vì ƣu điểm của phƣơng pháp này là nhanh chóng tạo đƣợc cây trƣởng thành. Cành đƣợc cắt từ các cây dầu mè đã trƣởng thành cắm xuống đất, nếu đƣợc chăm sóc cẩn thận thì sau khoảng 2 đến 3 tháng là có đƣợc cây đủ lớn để đem trồng. Cây tạo ra từ phƣơng pháp giâm cành sau khoảng 1 năm sẽ bắt đầu sinh sản (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006).
Trồng cây để khai thác dầu lâu năm thì phƣơng pháp nhân giống bằng gieo hạt đƣợc sử dụng nhiều hơn. Bởi những nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cây tạo thành từ nhân giống bằng giâm cành có đời sống ngắn hơn và khả năng chống hạn và bệnh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt. Rễ của cây giâm cành phát triển yếu dễ bị gẫy đổ (Heller, 1996). Hạt trƣớc khi đem gieo đƣợc lựa chọn là những hạt to, chắc, mẩy. Hạt đƣợc ngâm nƣớc qua đêm để làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Hôm sau, hạt đƣợc gieo vào trong các bầu đất. Hạt sẽ nẩy mầm sau khoảng 1 tuần và cây con có thể đem đi trồng sau 45 ngày. Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thƣờng có 1 rễ cái và 4 rễ bên. Cây trồng ngoài thực địa sẽ sinh sản sau khoảng 3 – 4 năm (Heller, 1996). Nhƣợc điểm của phƣơng pháp nhân giống bằng hạt là chất lƣợng cây con không đồng nhất bởi cây dâu mè là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt có sự khác nhau về
mặt di truyền. Nhƣ xét tính trạng hàm lƣợng dầu trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có hàm lƣợng dầu trong hạt không ổn định, giao động từ 4 đến 40 % (Timir baran Jha và ctv, 2007). Trong khi kiểm tra chất lƣợng hạt giống là một việc khó khăn thì tỉ lệ sống và nẩy mầm của hạt thấp do đó nhân giống bằng phƣơng pháp gieo hạt không thể đáp ứng đủ nhu cầy cây giống chất lƣợng tốt cho việc trồng cây trên qui mô công nghiệp.
2.2.4.2. Phƣơng pháp nhân giống hiện đại
Các phƣơng pháp nhân giống hiện đại có ƣu điểm lớn là có khả năng tạo giống cây với số lƣợng lớn trong khoảng thời gian ngắn với chất lƣợng cao và đồng nhất. Tuy nhiên những nghiên cứu này còn ít hoặc ít đƣợc công bố.
Năm 1995, M. Sujatha và N. Mukta đã phát triển kĩ thuật tái sinh cây dầu mè từ nhiều bộ phận khác nhau của cây nhƣ phần trụ dƣới lá mầm, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi non bất định đƣợc chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trƣờng MS bổ sung 2,22 M BA và 4,9 M IBA. Sau đó mô sẹo đƣợc tái sinh gián tiếp trên môi trƣờng MS bổ sung 0,44 M BA và 0,49 M IBA. Chồi non hình thành đƣợc nuôi và tạo rễ trong môi trƣờng MS không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng cho đến khi phát triển thành cây hoàn chỉnh để đƣa ra vƣờn ƣơm.
Năm 2005, M. Sujatha và các cộng sự đã thành công trong nhân giống in
vitro cây dầu mè bằng phƣơng pháp tạo cụm chồi. Nghiên cứu đã tạo chồi non bằng
cách nuôi nách lá cây dầu mè trên môi trƣờng MS bổ sung TDZ nồng đô 2,3 – 4,5 % sau đó chuyển sang môi trƣờng MS bổ sung IBA và BA. Hiệu quả tạo chồi cao 10 – 12,3 chồi/mẫu cấy. Việc tạo chồi bất định từ lá thu đƣợc bằng cách nuôi mẫu lá trên môi trƣờng bổ sung 8,9 – 44,4 M BA + 4,9 M indole-3-butyric acid (IBA) để tạo thành mô sẹo có màu trắng xanh, các chồi bất định sẽ đƣợc tạo thành sau khoảng 3 tuần sau đó chuyển sang môi trƣờng bổ sung 8,9 M BA + 2,5 M IBA.
Phƣơng pháp phát sinh phôi từ tế bào soma (somatic embryogenesis) - một công cụ mạnh của nghành công nghệ sinh học để tạo giống cây trồng – đã đƣợc áp dụng thành công lần đầu tiên trên cây dầu mè bởi Timir baran Jha và các cộng sự
(Timir baran Jha và ctv, 2007). Sụ phát sinh phôi soma đƣợc tạo ra bằng nuôi mẫu lá trên môi trƣờng MS có các chất kích thích sinh trƣởng thực vật Kinetin và IBA, phôi đƣợc khích thích phát triển bằng cách bổ sung thêm adenine sulphate trong môi trƣờng. Các phôi soma chín sẽ tạo các cây non trên môi trƣờng ½ MS. Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 – 16 tuần. Đây là nghiên cứu tiền đề cho những nghiên cứu về chuyển gen trên cây dầu mè về sau.
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2007 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công nghệ tế bào Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại TP.HCM.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tƣợng thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên cây dầu mè (Jatropha curcas L.) đƣợc trồng tại vƣờn giống Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình, đèn neon,…
Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, bình thuỷ tinh 500ml, đĩa, đèn cồn.
3.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Các môi trƣờng đƣợc sử dụng gồm: Môi trƣờng MS, ½ MS, WPM, ½ WPM. Trong đó môi trƣờng ½ MS và ½ WPM là môi trƣờng MS và WPM mà thành phần đa lƣợng đƣợc giảm đi một nửa.
- Môi trƣờng MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962)
Thành phần Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170
Khoáng vi lƣợng MnSO4.4H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Sắt EDTA Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Vitamin myo-Inositol 100 Thiamin (B1) 0,1 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine 2
- Môi trƣờng WPM ( Llooyd và McCown, 1981)
Thành phần Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 400 CaNO3 556 K2SO4 990 CaCl2 96 KH2PO4 170 MgSO4 370
Sắt EDTA FeNa2EDTA 65,1
ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Vitamin myo-Inositol 100 B1 1 B6 0,5 Nicotinic acid 0,5 Glycine 2
Các chất điều hoà sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng là BA, IBA (mg/l). Các thành phần khác:
Đƣờng sucrose 30 g/l Agar 7,5 /l
Môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng KOH 1N và HCl 1N) trƣớc khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm (1210C) trong 20 phút.
3.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày Nhiệt độ 25 2oC Độ ẩm 50 – 60 % Cƣờng độ ánh sáng 2000-3000 lux
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Phƣơng pháp khử trùng mẫu
- Ngoài tủ cấy:
Chồi đƣợc cắt dài khoảng 3 cm từ đỉnh chồi. Hạt đƣợc lấy từ những quả chín. Hạt phải có màu đen, chắc, mẩy.
Chồi đƣợc cắt bỏ lá non, rửa sạch nhiều lần dƣới vòi nƣớc máy, sau đó rửa trong dung dịch nƣớc xà phòng 0,1 % trong 15 phút và đƣợc rửa lại bằng nƣớc máy bình thƣờng.
Hạt đƣợc rủa sạch bằng nƣớc, dùng dao cạo bỏ lớp vở lụa mềm màu đen bên ngoài hạt, sau đó đƣợc rửa bằng xà phòng 0,1% trong 30 phút và đƣợc rủa lại bằng nƣớc máy nhiều lần.
- Trong tủ cấy vô trùng:
Rửa chồi và hạt bằng nƣớc cất vô trùng Lắc cồn 700 trong 30 giây
Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng
Ngâm trong Natri hypochlorit (NaOCl) - nồng độ và thời gian theo thí nghiệm.
Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng.
3.3.2. Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm đều đƣợc bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần và ở mỗi lần lập lại cấy 3 bình, trong mỗi bình cấy 3 mẫu. Mỗi bình chứa 50 ml môi trƣờng.
3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ sống của mẫu cây dầu mè thời gian khử mẫu đến tỉ lệ sống của mẫu cây dầu mè
Mẫu cấy sau khi đƣợc khử trùng trong tủ cấy sẽ đƣợc cắt theo từng đốt đều nhau dài khoảng 0,5 – 1 cm, loại bỏ những phần bị ngấm chất khử trùng rồi cấy vào các bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng.
Hạt đƣợc tách bỏ lớp vỏ cứng bằng kềm, pince và dao sau đó đƣợc cấy vào bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng.
Thời gian thực hiện: 7 – 10 ngày Môi trƣờng thí nghiệm: MS
Hóa chất đƣợc sử dụng là Natri hypochlorit (10 – 30 %)
Vật liệu thí nghiêm: thí nghiệm đƣợc thực hiện với 2 đối tƣợng là chồi và hạt cây dầu mè.
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian xử lý vô trùng mẫu
Nghiệm thức Nồng độ Natri hypochlorit (%) Thời gian (phút)