4.2.1. Bảo quản
Mẫu lá mắm đen không thể bảo quản lâu ở 40C. Cách bảo quản tốt nhất cho mẫu lá mắm đen là nên cho vào bịch nilong, ép hết không khí ra ngoài và trữ ở -200C. Đối với lá trƣởng thành có thể bảo quản trên 4 tuần. Còn đối với lá non thì việc bảo quản lâu không tốt, lá thƣờng hay bị hóa nâu đen. Vì có thể vách tế bào của lá non còn mềm nên khi bỏ vào tủ -200C thì tế bào dễ bị co rút và dễ bị vỡ cho nên các hợp chất thứ cấp trong tế bào lá non ra ngoài và làm cho lá bị hóa nâu, cùng với đó trong thời kì này lá non phát triển mạnh nên có nhiều hợp chất thứ cấp đƣợc hình thành nhƣ Phenol làm lá hóa nâu. Điều này có thể đã làm cho DNA bị đứt gẫy hay bị phân hủy trƣớc khi ly trích DNA tổng số. Cách tốt nhất là, lá non khi lấy mẫu về thì nên dùng trong 2 - 3 ngày.
4.2.2. Ly trích vật liệu di truyền
Chúng tôi khảo sát trên hai qui trình ly trích và nhận thấy một số điểm đáng lƣu ý sau.
Đối với qui trình ly trích Doyle và Doyle (1988).
Khi chúng tôi thực hiện theo qui trình của Doyle và Doyle (1988) thì kết quả thu đƣợc hàm lƣợng DNA không cao.
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA theo qui trình Doyle (1988)
Điều này rất có thể là do quá trình ly tâm ở tốc độ quá cao đã làm cho DNA bị đứt gẫy. Tại bƣớc 2 và 3 khi vortex quá mạnh, kỹ và đề thời gian tƣơng đối dài với Chloroform:Isoamyl alcohol đã làm cho DNA bị biến tính và đứt gẫy cho nên hàm lƣợng DNA thu đƣợc không cao. Do vậy, chúng tôi đã có một số lƣu ý ở những bƣớc này và thu đƣợc kết quả.
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA theo qui trình Doyle có cải tiến
Sản phẩm điện di cho thấy DNA tổng số cho band tƣơng đối tốt, band sáng và rõ, tạp phía dƣới tách biệt với band DNA tổng số, sản phẩm cho ít bị đứt gẫy. Chúng tôi tiến hành đo OD của những mẫu này thì thu đƣợc kết quả sau.
Bảng 4.1 : Bảng OD của 6 mẫu nghiền theo qui trình cải tiến
Mẫu OD260nm OD280nm OD260/OD280 Lƣợng DNA (ng/µl) 5A 0,026761 0,015763 1,69771 177,7886 4Ag 0,033635 0,021825 1,541123 199,2029 4An 0,03761 0,022284 1,66709 153,5203 3A 0,070867 0,041934 1,689965 294,791 2A 0,09279 0,054756 1,694609 386,5275 1A 0,023907 0,013311 1,796033 102,4554
Kết quả đo OD khá tốt đủ tiêu chuẩn dùng trong sinh học phân tử. Tuy nhiên, việc ly trích bằng dịch EB sẽ mất nhiều thời gian và công sức. Nghiền trong dung dịch EB thì phụ thuộc rất nhiều vào thao tác nghiền. Do vậy, kết quả thƣờng không ổn định.
Một số lƣu ý khi nghiền trong dịch EB.
Nên chọn những lá trƣởng thành, dịch EB nên ủ ở 650C trƣớc khi dùng và khi dùng mới bỏ β-mercaptroethanol vào dịch EB vì nhƣ thế β - mercaptroethanol sẽ bảo vệ DNA tốt hơn và phá hủy màng tế bào đƣợc tốt hơn.
Khi nghiền mẫu không nên nghiền mạnh tay, vortex tại bƣớc 1 vào khoảng 1000 - 1200 vòng/phút.
Tại bƣớc 2 và 3 không nên vortex và không để thời gian lâu vì nhƣ thế sẽ làm cho DNA dễ bị đứt gẫy hơn và dễ bị biến tính hơn. Nên đảo nhẹ tay trong 5 phút và ly tâm 11000 vòng/phút trong 10 phút.
Ở bƣớc 4 nên hút khoảng 250 – 300 ml dịch trong và không để đầu típ chạm vào giữa 2 pha, vì nhƣ thế sẽ làm cho protein sẽ đi theo và làm cho chất lƣợng DNA thu đƣợc không tốt.
Tại bƣớc 5 nên cho Isopropanol : mẫu theo tỉ lệ 1:1 và nên ủ qua đêm thì hiệu quả cho kết tủa của DNA tốt hơn.
Tại bƣớc 6 nên ly tâm ở 11000 vòng/phút trong 15 phút.
Bƣớc 7 khi cho TE 1X vào sẽ làm cho DNA hòa tan, nếu thấy DNA chƣa hòa tan hết thì nên kéo dài thời gian ủ.
Bƣớc 10 và 11 nên ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút. Nên phơi mẫu thật khô vì nếu không Ethanol còn lại sẽ làm cho DNA bị phá hủy, thƣờng thì chúng tôi phơi trong khoảng 2 - 3 giờ ở 370C. Nên bảo quản DNA ở -200
C. Qui trình ly trích bằng nitơ lỏng.
Chúng tôi nhận thấy khi nghiền trong dịch EB sẽ mất nhiều thời gian và công sức cùng với đó chất lƣợng DNA cho không cao còn tạp nhiều, tạp lắng không tốt sản phẩm hay bị smear. Do vậy, chúng tôi thử nghiệm qui trình ly trích bằng nitơ lỏng và thu đƣợc kết quả sau.
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA bằng nitơ lỏng
Chất lƣợng DNA thu đƣợc tốt hơn tạp ít hơn, tạp lắng tốt và DNA ít bị đứt gẫy. Qui trình này cho DNA tổng số khá ổn định. Mẫu 6 và 11 ta thấy tạp nhiều và hàm lƣợng DNA tổng số nhiều là do thao tác nghiền mẫu lúc cho mẫu vào eppendort quá nhiều làm cho hàm lƣợng DNA nhiều, cùng với đó mẫu lá quá non nên tế bào và màng nhân dễ vỡ nên giải phóng hàm lƣợng DNA nhiều. Mặt khác, giai đoạn này lá non đang phát triển mạnh nên tổng hợp nhiều hợp chất thứ cấp nhiều protien nên trong quá trình ly trích lá non tạp nhiều.
Chúng tôi tiến hành đo OD của 30 mẫu thì thu đƣợc kết quả theo phụ lục 4.2. Nhận thấy rằng mẫu OD đạt từ 1,4 trở lên trong đó tỷ lệ OD đạt từ 1,7 trở lên chiếm 67,7%, mẫu OD đạt từ 1,5 – 1,7 chiếm 22,58% và nồng độ DNA đạt từ 80 ng/µl đến 417 ng/µl. Qua đó chúng tôi thấy chất lƣợng DNA cho khá tốt, có thể dùng đƣợc trong nghiên cứu sinh học phân tử. Những mẫu có OD đạt từ 1,5 trở lên ta có thể dùng cho phản ứng RAPD-PCR. Chất lƣợng mẫu có tỷ lệ OD đạt từ 1,5 trở lên chiếm trên 90%. Điều này là quá tốt trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Cần dùng lá không quá non (là những lá trên đọt ngọn), trƣớc khi nghiền cần nên lau lá thật khô nƣớc.
Trong quá trình nghiền không để cho mẫu chảy nƣớc (mẫu hết lạnh) vì nhƣ thế các hợp chất thứ cấp trong tế bào sẽ hòa tan ra ngoài và phá hủy DNA. Khi nào dùng dịch EB thì mới bỏ β-mercaptroethanol vì nhƣ thế thì hiệu quả
bảo vệ DNA sẽ tốt hơn và cần để dịch EB ở 650C. Trong dịch EB lúc này cần bổ sung thêm Polyvinyl pyrrolidone 2 g trong 100 ml dịch EB, thì hiệu quả sẽ tốt hơn. Vì Polyvinyl pyrrolidone có tác dụng làm biến tính các Polyssacharid.
Khi cho dịch EB vào thì nên vortex ngay để dịch EB trộn đều và bảo vệ DNA đƣợc tốt, nên vortex 1400 vòng/phút.
Bƣớc 4 nên ủ Isopropanol qua đêm.
Giai đoạn phơi mẫu thì cần nên phơi mẫu thật khô thƣờng thì 2 - 3 giờ trong tủ hút.
Trong hai qui trình ly trích trên chúng tôi nhận thấy nên ly trích theo qui trình nghiền trong nitơ lỏng. Vì hiệu quả cho sản phẩm DNA tổng số khá tốt tạp ít, tạp lắng tốt, DNA ít bị đứt gẫy. Thời gian nghiền mẫu nhanh, nghiền đƣợc số lƣợng mẫu lớn.
4.3. Kết quả phản ứng RAPD-PCR
Thí nghiệm 1 : Chúng tôi tiến hành khảo sát các mồi.
Đối với primer OPA10 và OPA5, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 340C và thu đƣợc kết quả sau.
Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA10 và OPA5
Kết quả điện di không thấy band. Điều này có thể là do nguyên nhân.
- Trình tự mồi không bắt cặp với DNA của bộ gen hay không có vị trí tƣơng đồng trên bộ gen.
- Lƣợng MgCl2 cho vào quá cao đã làm ức chế hoạt động của Taq DNA polymerase.
- Lƣợng mồi quá nhiều cũng gây ảnh hƣởng đến quá trình bắt cặp và kéo dài. - Taq DNA polymerase chƣa đủ hoạt tính.
- Chu kỳ nhiệt chƣa thích hợp.
Qua hai mồi OPA10 và OPA5 chúng tôi không thu đƣợc kết quả. Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát những mồi tiếp theo.
Đối với OPD18, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 340C và kết quả thu đƣợc nhƣ sau.
Sản phẩm RAPD-PCR
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA18
Hình điện di cho ta thấy có sản phẩm RAPD-PCR nhƣng band cho không tách rõ ràng, band còn mờ. Điều này có thể là do nguyên nhân.
- Chu kì nhiệt chƣa tốt. - Lƣợng mồi còn quá cao.
- Hàm lƣợng MgCl2 còn cao nên đã có phần gây ức chế hoạt động của Taq
DNA polymerase.
- Taq DNA polymerase chƣa đủ hoạt tính để kéo dài sản phẩm. Nên cần phải điều chỉnh thêm trong quá trình cần nghiên cứu tiếp.
Đối với primer 1, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 380C. Chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm trên ba loại cây mắm (mắm đen, mắm biển và mắm trắng) thì chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau.
Mắm biển Mắm đen
Mắm trắng
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer 1
Kết quả điện di chỉ cho một band đồng hình duy nhất sáng và rõ, nên không có ý nghĩa trong nghiên cứu đa dạng di truyền cho cây mắm. Tuy nhiên, ở đây có thể
band này là đặc trƣng cho cây mắm và có thể là marker để chỉ thị cho cây mắm với những cây khác.
400bp
Hình 4.8. Kích thƣớc band phản ứng RAPD-PCR của primer 1
Chúng tôi xác định kích thƣớc band này là vào khoảng 400pb (hình 4.8). Cần nên giải trình tự band này nhằm mục đích phục vụ cho công tác chọn giống và nghiên cứu đặc thù cây mắm ở rừng ngập mặn Cần Giờ.
Đối với OPAC10, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 360C. Chúng tôi tiến hành khảo sát mồi này và thu đƣợc kết quả nhƣ sau.
Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPAC10
Kết quả thu đƣợc cho thấy rằng có thể sử dụng mồi này dùng làm trong nghiên cứu tiếp theo. Kết quả điện di cho hai band đồng hình rất rõ và sáng kích thƣớc khá gần nhau. Những band có kích thƣớc lớn hơn hay nhỏ hơn thì mờ, điều này có thể là do nguyên nhân.
- Trên bộ gen có nhiều đoạn gen có kích thƣớc gần với hai band đồng hình này.
- Vị trí bắt cặp giữa mồi và DNA này dễ xảy ra, cùng với hàm lƣợng mồi cao và nồng độ DNA mẫu cao nên đã có sự bắt cặp nhiều giữa DNA và mồi đã
làm cho Taq DNA polymerase hoạt động gần hết. Do vậy, mà những vị trí khác lƣợng Taq DNA polymerase không đủ hoạt tính.
- Chu trình nhiệt chƣa phù hợp.
- Nồng độ MgCl2 còn cao đã làm hạn chế hoạt động của Taq DNA polymerase.
Do vậy, cần có những điều chỉnh tiếp theo để cho kết quả phù hợp dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền.
Thí nghiệm 2 : Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer OPAC10 lên kết quả RAPD-PCR.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau :
Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 2
Nghiệm thức 2 và 3 ta thu đƣợc 4 - 6 band, band phân tách rõ và độ sáng band đều. Điều này cho thấy, ở nồng độ primer 0,8 pM/µl và 0,6 pM/µl cho kết quả phản ứng RAPD-PCR tốt hơn. Tuy nhiên, có một số band chƣa có phân tách rõ và một số band còn mờ. Điều này có thể là do hàm lƣợng MgCl2 chƣa thật tối ƣu để cho Taq
DNA polymerase hoạt động tốt. Do vậy, cần phải điều chỉnh nồng độ MgCl2. Thí nghiệm 3: Sử dụng primer OPAC10 làm thí nghiệm tối ƣu.
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ MgCl2 trên hai nồng độ mồi và thu đƣợc kết quả sau.
Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm của thí nghiệm 3
Kết quả điện di cho thấy ở nghiệm thức 3 và 4 cho sản phẩm RAPD-PCR khá ổn định. Số band đạt từ 5 band/mẫu, độ sáng band tƣơng đối đều. Do vậy, ta có thể làm ở những nồng độ này trong nghiên cứu tiếp theo.
Thí nghiệm 4 : Sử dụng primer OPAC10 làm thí nghiệm cho nghiên cứu sự đa
dạng di truyền.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
đa hình
đồng hình Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của mồi OPAC10 khi đã tối ƣu
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR tƣơng đối tốt band sáng và rõ, tuy nhiên độ đa hình không cao.
Chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR trên primer OPAC10 của 11 mẫu kết quả điện di thu đƣợc 5,4 band/mẫu. Trong đó band đồng hình 5 band chiếm tỷ lệ 62,5% band đa hình có 3 band chiếm tỷ lệ 37,5%. Kích thƣớc band sản phẩm 150bp – 1000bp, kích thƣớc band đồng hình luôn xuất hiện 150bp, 250bp, 350bp 550bp và 650bp. Kích thƣớc band đa hình 400bp, 750bp và 1000bp. Tuy nhiên lƣợng mẫu
nghiên cứu không lớn chỉ 11 mẫu chƣa thấy đƣợc hết sự đa dạng di truyền của cây mắm đen.
Từ kết quả điện di chúng tôi mã hóa số liệu theo dạng nhị phân 0 và 1 những mẫu có band là 1 không có band là 0 theo phụ lục 4.3. Kết quả xử lý đƣợc phân tích trên phần mềm NTSYTpc phiên bản 2.1 chúng tôi thu đƣợc kết quả sau.
a
b
Hình 4.13. Cây phân nhóm di truyền của 11 mẫu mắm đen
Từ cây phân nhóm di truyền cho thấy hệ số đồng dạng di truyền khá cao từ 0,54 đến 1 và cây phân nhóm di truyền đƣợc chia làm hai nhóm phân biệt nhóm I và nhóm II. Trong nhóm I gồm có nhóm a, nhóm b và mẫu cây mắm đen A4. Nhóm II chỉ có một mẫu cây mắm đen A19. Từ bảng ma trận tƣơng đồng ở phụ lục 4.4 ta thấy hệ số đồng dạng di truyền giữa nhóm a và nhóm b là khá cao 0,875 điều này có thể là do các cây có cùng một nguồn gốc giống bố mẹ từ tự nhiên. Xem xét vị trí lấy mẫu thì nhận thấy rằng các mẫu này lấy cùng đợt 1 trên cùng một đƣờng đi. Điều này có thể là nguyên nhân thuận lợi để cho gió và côn trùng giúp cho sự giao phấn chéo giữa các cây cận huyết hay là sự phát tán các cây có cùng một nguồn gốc bồ mẹ, mà ta thấy rõ nhất các mẫu cây A1, A7, A8, A10, A12 của nhóm a chủ yếu thuộc tiểu khu 17 và 21 hay A15, A17, A18, A20 của nhóm b chủ yếu là thuộc tiểu khu 10 và 5B có vị trí lấy mẫu khá gần nhau và hệ đồng dạng di truyền của nhóm a hay nhóm b là 100%. Trong tƣơng lai gần nếu không du nhập giống mới từ những địa phƣơng khác vào thì nguy cơ
Nhóm I
cây giữa nhóm a và nhóm b sẽ đạt hệ số đồng dạng di truyền tăng dần. Điều này sẽ không tốt, và gây nguy hại cho quần thể cây này có thể chết hàng loạt khi cây nhiễm bệnh.
Trong nhóm II chỉ có một mẫu cây A19 có hệ số đồng dạng di truyền so với nhóm I là 0,54. Xem xét vị trí lấy mẫu thì cây A19 thuộc tiểu khu 5B , mẫu lấy gần nhóm b nên hệ số đồng dạng di truyền so với nhóm này là 0,625. Còn nhóm a thì tƣơng đối xa do vậy hệ số đồng dạng di truyền có sự khác biệt 0,5. Điều này cũng là tất yếu, vì khoảng cách có sự khác biệt nên quá trình thụ phấn chéo cũng bị ảnh hƣởng. Nhìn chung cây A19 có sự khác biệt với những cây trong nhóm I. Điều này có thể là do nguyên nhân bị ảnh hƣởng của môi trƣờng làm cây bị biến đổi những cặp alen