3.4.5.1. Primer sử dụng
Những primer đƣợc sử dụng trong nghiên cứu.
Bảng 3.3. Danh sách những primer dùng trong nghiên cứu
Tên primer Trình tự Tm OPA10 GTGATCGCAG 30,7 OPA5 AGGGGTCTTG 30,2 OPD18 GAGAGCCAAC 31,9 Primer 1 TGCCGAGCTG 40,7 OPAC10 AGCAGCGAGG 34 3.4.5.2. Bố trí thí nghiệm
Chọn những mẫu có độ tinh sạch cao để thực hiện phản ứng RAPD-PCR.
Thí nghiệm 1:
Mục đích: Chúng tôi khảo sát mồi, xem xét những mồi nào thích hợp cho phản ứng RAPD-PCR.
Bàng 3.4. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 Hóa chất Dung dịch gốc L hút Nđ cuối
PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X
MgCl2 25 mM 3 µl 3 mM
Primer 100 pM/µl 0,3 µl 1,2 pM/µl
dNTP 25 mM 0,2 µl 0,2 mM
Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,2 µl 1 U
DNA mẫu 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl
Nƣớc 17,8 µl
Bảng 3.5. Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 5 45 94 0,5 Ta 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002) Chỉ tiêu đánh giá: Các band DNA trên gel điện di.
Thí nghiệm 2:
Mục đích: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ primer đến qui trình RAPD-PCR. Phƣơng pháp tiến hành: Theo quy trình sau.
Bảng 3.6: Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD–PCR của thí nghiệm 2 Thành phần hóa chất Dung dịch gốc
Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3
L hút Nđ cuối L hút Nđ cuối L hút Nđ cuối
PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X 2,5 µl 1X 2,5 µl 1 X MgCl2 25 mM 3 µl 3 mM 3 µl 3mM 3 µl 3 mM Primer 100 pM/µl 0,25 µl 1 pM/µl 0,2 µl 0,8 pM/µl 0,15 µl 0,6 pM/µl dNTP 25 mM 0,2 µl 0,2 mM 0,2 µl 0,2 mM 0,2 µl 0,2 mM Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,2 µl 1 U 0,2 µl 1 U 0,2 µl 1 U DNA mẫu 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl Nƣớc 17,85 µl 18,1 µl 17,95 µl
Bảng 3.7: Chƣơng trình nhiệt của phản ứng RAPD–PCR cho thí nghiệm 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 5 45 94 0,5 36 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002) Chỉ tiêu đánh giá: Các band DNA trên gel điện di.
Thí nghiệm 3:
Mục đích: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ MgCl2 và primer đến phản ứng RAPD - PCR.
Phƣơng pháp tiến hành: Theo quy trình sau.
Bảng 3.8: Bảng hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 Nghiệm thức Hóa chất Dung dịch gốc L hút Nđ cuối Nghiệm thức 1 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2,5 µl 0,2 µl 2,5 mM 0,8 pM/µl Nghiệm thức 2 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2 µl 0,2 µl 2 mM 0,8 pM/µl Nghiệm thức 3 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2,5 µl 0,15 µl 2,5 mM 0,6 pM/µl Nghiệm thức 4 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2 µl 0,15 µl 2 mM 0,6 pM/µl
Bảng 3.9: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD–PCR của thí nghiệm 3 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 5 45 94 0,5 36 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002) Chỉ tiêu đánh giá: Số lƣợng và chất lƣợng các band DNA trên gel điện di. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm 4
Mục đích: Dùng RAPD-PCR để nghiên cứu sự đa dạng cây mắm đen. Phƣơng pháp tiến hành: Theo qui trình sau.
Bảng 3.10. Thành phần hóa chất cho RAPD-PCR của thí nghiệm 4 Hóa chất Dung dịch gốc L hút N đ cuối
PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X
MgCl2 25 mM 2,5 µl 2,5 mM
Primer 100 pM/µl 0,15 µl 0,6 pM/µl
dNTP 25 mM 0,2 µl 0,2 mM
Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,2 µl 1 U
DNA mẫu 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl
Nƣớc 17,8 µl
Bảng 3.11. Chu trình nhiệt cho RAPD-PCR của thí nghiệm 4 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 5 45 94 0,5 36 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002) Chỉ tiêu đánh giá: Số lƣợng các band DNA trên gel điện di.
Sau khi đã tối ƣu cho qui trình RAPD-PCR chúng tôi tiến hành chọn 11 mẫu để nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm đen.
3.4.6. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYSpc
Các band thu đƣợc từ kết quả điện di của phản ứng RAPD-PCR sẽ đƣợc mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1. Band nào có thì chuyển thành 1, band không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa đƣợc lƣu dƣới dạng file Excel và chuyển sang phần mềm NTSYSpc phiên bản 2.1 để xử lý.
Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979).
Sxy = 2 xy/(x + y)
với xy: Số band giữa hai mẫu. x: Số band của mẫu x. y: Số band của mẫu y.
Sxy: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa x và y.
Dxy = 1 - Sxy
Từ kết quả phân nhóm dựa trên kiểu gen và nhận xét mối tƣơng quan dựa trên các đặc điểm hình thái, rút ra kết luận về sự đa dạng di truyền ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thu thập mẫu tại các tiểu khu rừng ngập mặn Cần Giờ
Chúng tôi tiến hành thu thập 50 mẫu lá cây mắm đen, tại các tiểu khu của rừng ngập mặn Cần Giờ. Quá trình thu thập mẫu đƣợc tiến hành theo đƣờng chéo của khu rừng khoảng cách lấy mẫu là vào khoảng 500 m, có máy định vị GPS. Tiến trình lấy mẫu chủ yếu theo đƣờng bộ hai bên đƣờng đi hay theo đƣờng thủy dọc hai bên mé sông và kênh rạch. Vị trí lấy mẫu đƣợc thể hiện trên bản đồ sau.
Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu mắm đen ở Cần Giờ
Quá trình lấy mẫu đƣợc chia làm 2 đợt. Đợt 1 lấy 20 mẫu lá mắm đen từ mẫu A1 đến A20 theo đƣờng bộ bằng phƣơng tiện xe máy, đƣợc biểu thị trên bản đồ là những chấm đen. Đợt 2 lấy 30 mẫu lá mắm đen từ mẫu A21 đến A50 theo đƣờng thủy bằng phƣơng tiện ghe máy, đƣợc biểu thị bằng chấm đỏ trên bản đồ.
Hạn chế của việc lấy mẫu là không đi vào bên trong của khu rừng, vì đƣờng đi rất khó, nƣớc ngập, sình lầy và bùn lún. Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu là dựa vào những đặc điểm của cây nhƣ: Chiều cao cây, thân hình cây, hoa, trái, lá cây. Đặc điểm của cây lấy mẫu đƣợc ghi nhận ở phần phụ lục 4.1.
4.2. Bảo quản và ly trích vật liệu di truyền 4.2.1. Bảo quản 4.2.1. Bảo quản
Mẫu lá mắm đen không thể bảo quản lâu ở 40C. Cách bảo quản tốt nhất cho mẫu lá mắm đen là nên cho vào bịch nilong, ép hết không khí ra ngoài và trữ ở -200C. Đối với lá trƣởng thành có thể bảo quản trên 4 tuần. Còn đối với lá non thì việc bảo quản lâu không tốt, lá thƣờng hay bị hóa nâu đen. Vì có thể vách tế bào của lá non còn mềm nên khi bỏ vào tủ -200C thì tế bào dễ bị co rút và dễ bị vỡ cho nên các hợp chất thứ cấp trong tế bào lá non ra ngoài và làm cho lá bị hóa nâu, cùng với đó trong thời kì này lá non phát triển mạnh nên có nhiều hợp chất thứ cấp đƣợc hình thành nhƣ Phenol làm lá hóa nâu. Điều này có thể đã làm cho DNA bị đứt gẫy hay bị phân hủy trƣớc khi ly trích DNA tổng số. Cách tốt nhất là, lá non khi lấy mẫu về thì nên dùng trong 2 - 3 ngày. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.2.2. Ly trích vật liệu di truyền
Chúng tôi khảo sát trên hai qui trình ly trích và nhận thấy một số điểm đáng lƣu ý sau.
Đối với qui trình ly trích Doyle và Doyle (1988).
Khi chúng tôi thực hiện theo qui trình của Doyle và Doyle (1988) thì kết quả thu đƣợc hàm lƣợng DNA không cao.
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA theo qui trình Doyle (1988)
Điều này rất có thể là do quá trình ly tâm ở tốc độ quá cao đã làm cho DNA bị đứt gẫy. Tại bƣớc 2 và 3 khi vortex quá mạnh, kỹ và đề thời gian tƣơng đối dài với Chloroform:Isoamyl alcohol đã làm cho DNA bị biến tính và đứt gẫy cho nên hàm lƣợng DNA thu đƣợc không cao. Do vậy, chúng tôi đã có một số lƣu ý ở những bƣớc này và thu đƣợc kết quả.
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA theo qui trình Doyle có cải tiến
Sản phẩm điện di cho thấy DNA tổng số cho band tƣơng đối tốt, band sáng và rõ, tạp phía dƣới tách biệt với band DNA tổng số, sản phẩm cho ít bị đứt gẫy. Chúng tôi tiến hành đo OD của những mẫu này thì thu đƣợc kết quả sau.
Bảng 4.1 : Bảng OD của 6 mẫu nghiền theo qui trình cải tiến
Mẫu OD260nm OD280nm OD260/OD280 Lƣợng DNA (ng/µl) 5A 0,026761 0,015763 1,69771 177,7886 4Ag 0,033635 0,021825 1,541123 199,2029 4An 0,03761 0,022284 1,66709 153,5203 3A 0,070867 0,041934 1,689965 294,791 2A 0,09279 0,054756 1,694609 386,5275 1A 0,023907 0,013311 1,796033 102,4554
Kết quả đo OD khá tốt đủ tiêu chuẩn dùng trong sinh học phân tử. Tuy nhiên, việc ly trích bằng dịch EB sẽ mất nhiều thời gian và công sức. Nghiền trong dung dịch EB thì phụ thuộc rất nhiều vào thao tác nghiền. Do vậy, kết quả thƣờng không ổn định.
Một số lƣu ý khi nghiền trong dịch EB.
Nên chọn những lá trƣởng thành, dịch EB nên ủ ở 650C trƣớc khi dùng và khi dùng mới bỏ β-mercaptroethanol vào dịch EB vì nhƣ thế β - mercaptroethanol sẽ bảo vệ DNA tốt hơn và phá hủy màng tế bào đƣợc tốt hơn.
Khi nghiền mẫu không nên nghiền mạnh tay, vortex tại bƣớc 1 vào khoảng 1000 - 1200 vòng/phút.
Tại bƣớc 2 và 3 không nên vortex và không để thời gian lâu vì nhƣ thế sẽ làm cho DNA dễ bị đứt gẫy hơn và dễ bị biến tính hơn. Nên đảo nhẹ tay trong 5 phút và ly tâm 11000 vòng/phút trong 10 phút.
Ở bƣớc 4 nên hút khoảng 250 – 300 ml dịch trong và không để đầu típ chạm vào giữa 2 pha, vì nhƣ thế sẽ làm cho protein sẽ đi theo và làm cho chất lƣợng DNA thu đƣợc không tốt.
Tại bƣớc 5 nên cho Isopropanol : mẫu theo tỉ lệ 1:1 và nên ủ qua đêm thì hiệu quả cho kết tủa của DNA tốt hơn.
Tại bƣớc 6 nên ly tâm ở 11000 vòng/phút trong 15 phút.
Bƣớc 7 khi cho TE 1X vào sẽ làm cho DNA hòa tan, nếu thấy DNA chƣa hòa tan hết thì nên kéo dài thời gian ủ.
Bƣớc 10 và 11 nên ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút. Nên phơi mẫu thật khô vì nếu không Ethanol còn lại sẽ làm cho DNA bị phá hủy, thƣờng thì chúng tôi phơi trong khoảng 2 - 3 giờ ở 370C. Nên bảo quản DNA ở -200
C. Qui trình ly trích bằng nitơ lỏng.
Chúng tôi nhận thấy khi nghiền trong dịch EB sẽ mất nhiều thời gian và công sức cùng với đó chất lƣợng DNA cho không cao còn tạp nhiều, tạp lắng không tốt sản phẩm hay bị smear. Do vậy, chúng tôi thử nghiệm qui trình ly trích bằng nitơ lỏng và thu đƣợc kết quả sau.
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA bằng nitơ lỏng
Chất lƣợng DNA thu đƣợc tốt hơn tạp ít hơn, tạp lắng tốt và DNA ít bị đứt gẫy. Qui trình này cho DNA tổng số khá ổn định. Mẫu 6 và 11 ta thấy tạp nhiều và hàm lƣợng DNA tổng số nhiều là do thao tác nghiền mẫu lúc cho mẫu vào eppendort quá nhiều làm cho hàm lƣợng DNA nhiều, cùng với đó mẫu lá quá non nên tế bào và màng nhân dễ vỡ nên giải phóng hàm lƣợng DNA nhiều. Mặt khác, giai đoạn này lá non đang phát triển mạnh nên tổng hợp nhiều hợp chất thứ cấp nhiều protien nên trong quá trình ly trích lá non tạp nhiều.
Chúng tôi tiến hành đo OD của 30 mẫu thì thu đƣợc kết quả theo phụ lục 4.2. Nhận thấy rằng mẫu OD đạt từ 1,4 trở lên trong đó tỷ lệ OD đạt từ 1,7 trở lên chiếm 67,7%, mẫu OD đạt từ 1,5 – 1,7 chiếm 22,58% và nồng độ DNA đạt từ 80 ng/µl đến 417 ng/µl. Qua đó chúng tôi thấy chất lƣợng DNA cho khá tốt, có thể dùng đƣợc trong nghiên cứu sinh học phân tử. Những mẫu có OD đạt từ 1,5 trở lên ta có thể dùng cho phản ứng RAPD-PCR. Chất lƣợng mẫu có tỷ lệ OD đạt từ 1,5 trở lên chiếm trên 90%. Điều này là quá tốt trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Cần dùng lá không quá non (là những lá trên đọt ngọn), trƣớc khi nghiền cần nên lau lá thật khô nƣớc.
Trong quá trình nghiền không để cho mẫu chảy nƣớc (mẫu hết lạnh) vì nhƣ thế các hợp chất thứ cấp trong tế bào sẽ hòa tan ra ngoài và phá hủy DNA. Khi nào dùng dịch EB thì mới bỏ β-mercaptroethanol vì nhƣ thế thì hiệu quả
bảo vệ DNA sẽ tốt hơn và cần để dịch EB ở 650C. Trong dịch EB lúc này cần bổ sung thêm Polyvinyl pyrrolidone 2 g trong 100 ml dịch EB, thì hiệu quả sẽ tốt hơn. Vì Polyvinyl pyrrolidone có tác dụng làm biến tính các Polyssacharid.
Khi cho dịch EB vào thì nên vortex ngay để dịch EB trộn đều và bảo vệ DNA đƣợc tốt, nên vortex 1400 vòng/phút.
Bƣớc 4 nên ủ Isopropanol qua đêm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giai đoạn phơi mẫu thì cần nên phơi mẫu thật khô thƣờng thì 2 - 3 giờ trong tủ hút.
Trong hai qui trình ly trích trên chúng tôi nhận thấy nên ly trích theo qui trình nghiền trong nitơ lỏng. Vì hiệu quả cho sản phẩm DNA tổng số khá tốt tạp ít, tạp lắng tốt, DNA ít bị đứt gẫy. Thời gian nghiền mẫu nhanh, nghiền đƣợc số lƣợng mẫu lớn.
4.3. Kết quả phản ứng RAPD-PCR
Thí nghiệm 1 : Chúng tôi tiến hành khảo sát các mồi.
Đối với primer OPA10 và OPA5, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 340C và thu đƣợc kết quả sau.
Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA10 và OPA5
Kết quả điện di không thấy band. Điều này có thể là do nguyên nhân.
- Trình tự mồi không bắt cặp với DNA của bộ gen hay không có vị trí tƣơng đồng trên bộ gen.
- Lƣợng MgCl2 cho vào quá cao đã làm ức chế hoạt động của Taq DNA polymerase.
- Lƣợng mồi quá nhiều cũng gây ảnh hƣởng đến quá trình bắt cặp và kéo dài. - Taq DNA polymerase chƣa đủ hoạt tính.
- Chu kỳ nhiệt chƣa thích hợp.
Qua hai mồi OPA10 và OPA5 chúng tôi không thu đƣợc kết quả. Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát những mồi tiếp theo.
Đối với OPD18, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 340C và kết quả thu đƣợc nhƣ sau.
Sản phẩm RAPD-PCR
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA18
Hình điện di cho ta thấy có sản phẩm RAPD-PCR nhƣng band cho không tách rõ ràng, band còn mờ. Điều này có thể là do nguyên nhân.
- Chu kì nhiệt chƣa tốt. - Lƣợng mồi còn quá cao.
- Hàm lƣợng MgCl2 còn cao nên đã có phần gây ức chế hoạt động của Taq
DNA polymerase.
- Taq DNA polymerase chƣa đủ hoạt tính để kéo dài sản phẩm. Nên cần phải điều chỉnh thêm trong quá trình cần nghiên cứu tiếp.
Đối với primer 1, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở nhiệt độ Ta là 380C. Chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm trên ba loại cây mắm (mắm đen,