Phƣơng pháp AFLP đƣợc xây dựng bởi công ty KeyGene và là phƣơng pháp kết hợp giữa RFLP và RAPD. Phƣơng pháp AFLP bao gồm các giai đoạn.
Tách chiết DNA.
Cắt DNA bằng enzyme giới hạn.
Nối trình tự các đoạn DNA đƣợc cắt với các adapter. Khuếch đại các đoạn cắt giới hạn.
Chạy điện di các đoạn khuếch đại trên gel polyarylamide hay gel agarose. Ở phƣơng pháp này mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adapter và đƣợc gắn thêm 1 nucleotide chọn lọc ở đầu 3’, gọi là primer+1: Là primer tiền chọn lọc. Adapter gắn 2 - 3 nucleotide thì gọi là primer chọn lọc. Một nucleotide chọn lọc có thể là A, C, G, T. Hai nucleotide chọn lọc là những tổ hợp của A, C, T, G nhƣ là: AA, AG, AT,…. Ba nucleotide có thể là: AAA, ATG, ACC,….
DNA mẫu đƣợc khuếch đại hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Giai đoạn khuếch đại tiền chọn lọc với primer+1. Giai đoạn 2: Giai đoạn khuếch đại chọn lọc với primer+2(3).
Sự chọn lọc ở đây có ý nghĩa:
Chỉ những trình tự DNA nào gắn với adapter mới đƣợc khuếch đại.
Sự khuếch đại tiền chọn lọc giúp chọn lọc bƣớc đầu các trình tự DNA cần đƣợc khuếch đại.
Sự khuếch đại chọn lọc giúp chọn lọc chặt chẽ hơn các trình tự DNA cần đƣợc khuếch đại.
Trong phƣơng pháp AFLP việc ly trích thành phần DNA là khâu hết sức quan trọng, để mà có đƣợc DNA tinh khiết ít bị tạp nhiễm. Cùng với đó những thành phần làm dung dịch đệm cho enzyme cắt và enzyme gắn cũng quyết định sự thành công của kỹ thuật này. Sự thiết kế mồi dựa trên các adapter, mồi đƣợc thiết kế phải phù hợp sao cho có sự cân đối giữa các thành phần theo tỷ lệ:
%G + C = 60%, kích thƣớc 17 – 28 base = L Tm = 59,9 + 0,41*(%G,C) – 600/L. Tanneal = Tm-primer - 40C. Tm-product – Tanneal >= 300C. Tm: Nhiệt độ nóng chảy. Tanneal: Nhiệt độ bắt cặp.
Tm-primer: Nhiệt độ nóng chảy của mồi.
Tm- product : Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm.
Ƣu điểm:
Lƣợng DNA cần dùng ít.
Tạo nhiều band khuếch đại khả năng đa hình cao. Kết quả có độ tin cậy cao, có khả năng lặp lại. Không cần biết trƣớc trình tự genome.
Nhƣợc điểm:
Chi phí cao.
Không kiểm soát hết sự bắt cặp của các adapter. Enzyme cắt và gắn có thể hoạt động không tốt. Cần chất lƣợng DNA mẫu cao.
Ứng dụng của phƣơng pháp này:
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể. Đánh giá sự tƣơng quan di truyền giữa các cá thể. Lập bản đồ di truyền, chọn giống.
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Nội dung đề tài
Đề tài đƣợc thực hiện với hai nội dung sau:
Thu thập mẫu cây mắm đen tại rừng ngập mặn Cần Giờ.
Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen bằng kỹ thuật RAPD.
3.2. Thời gian thực hiện đề tài
Thời gian bắt đầu thực hiện đề tài từ ngày 1 tháng 5 năm 2007 đến ngày 1 tháng 9 năm 2007 tại rừng ngập mặn Cần Giờ và phòng CNSH thực vật của Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
3.3. Vật liệu
3.3.1. Mẫu mắm đen
Mẫu mắm đen (Avicennia officinalis) đƣợc lấy ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
Cách thức lấy mẫu:
Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).
Thu thập lá của cây mắm đen nhiều hình dạng nhƣ: Lá già, lá non, lá bánh tẻ, lá bị thủng lổ, lá bị sâu bọ ăn, lá nhỏ, lá to.
Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: Thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng, lá khác lạ v/v.
Chọn mẫu lá từ trên những cây mắm đen có năm tuổi khác nhau (cây có gốc lớn, cây có gốc lớn sống cằn cỗi, cây có gốc nhỏ có sức sống tốt, cây có gốc nhỏ sống cằn cỗi).
Mỗi cây lấy khoảng 5 - 10 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá. Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây đƣợc lấy mẫu.
Mẫu sau khi lấy đƣợc cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời. Sau đó, nên chuyển ngay về phòng thí nghiệm cho vào tủ lạnh -200C.
3.3.2. Hóa chất thí nghiệm
3.3.2.1. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA
Chloroform:Isoamyl alcohol = 24:1. Polyvinyl pyrrolidone (PVP). Sodium acetat 3 M. Ethanol 100%. Isopropanol. Ethanol 70%. Dịch trích DNA (EB).
Bảng 3.1. Thành phần dung dịch ly trích DNA (EB).
Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 100ml) CTAB (hexade- cyltrimethylammoniumbromide) EDTA 0,5 M β - mercaptroethanol NaCl 5 M Tris – HCl 1 M Nƣớc 2 g. 4 ml. 1 ml. 28 ml. 10 ml. Thêm cho đến 100 ml.
TE 1X (Tris-HCl, EDTA). Bảng 3.2. Thành phần dung dịch TE 1X. Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 250 ml) Tris – HCl 1 M EDTA 0,5 M 1 ml. 0,2 ml
3.3.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA
Nƣớc cất 2 lần khử ion (đã hấp khử trùng). TE 1X.
3.3.2.3. Hóa chất dùng trong định tính DNA
Agarose.
Ethidium bromide. TAE.
3.3.2.4. Hóa chất dùng để cho phản ứng RAPD-PCR
PCR buffer. dNTP.
Taq DNA polymerase (promega) MgCl2.
Primer OPA5, primer OPA10, primer OPD18, primer l, primer OPAC10. DNA mẫu.
Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV.
3.3.3. Trang thiết bị
- Chén sứ và chày giã (Đức) - Máy Vortex (IKA - Đức) - Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) - Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) - Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) - Tủ sấy (Jencons-Anh)
- Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) - Máy điện di (Biorad) - Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) - Lò Viba (Electrolux) - Máy chụp ảnh DNA (Biorad-Thụy Điển) - Đầu típ các loại (Đức) - Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) - Máy PCR (PTC 100 - MJ)
- Pipet các loại (Nichiryo - Nhật Bản)
3.4. Phƣơng pháp
3.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu của đề tài là DNA đƣợc ly trích từ mẫu lá của cây mắm đen.
3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp RAPD-PCR để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen.
3.4.3. Cách bố trí thí nghiệm
Giai đoạn1 : Tách triết DNA từ các mẫu mắm đen đƣợc thu thập. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di và định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp đo quang phổ.
Giai đoạn 2 : Khảo sát các thành phần tối ƣu hóa phƣơng pháp RAPD-PCR trong phân tích đa dạng di truyền của các mẫu mắm đen đƣợc thu thập. Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ mồi và nồng độ muối đến phản ứng RAPD-PCR.
Giai đoạn 3 : Khảo sát tính đa dạng di truyền của các mẫu mắm đen thu đƣợc và phát hiện ra chỉ thị phân tử.
Giai đoạn 4 : Đánh giá đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc.
3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA
3.4.4.1.Quy trình ly trích mẫu tƣơi Doyle và Doyle (1988)
Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch ly trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ, ủ ở 650C trong 45 phút.
Bƣớc 2: Thêm 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol, khuấy bằng vortex 10 phút, ly tâm 5 phút 14000 vòng ở 100C.
Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.
Bƣớc 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 µl RNase, ủ ở 370C trong 1 giờ. Bƣớc 5: Thêm vào 250 µl dung dịch Isopropanol lạnh. Để tủa ở –200
C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).
Bƣớc 6: Ly tâm 5 phút 14000 vòng ở 100C. Đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 7: Cho vào 300 µl TE 1X, ủ ở 370
Bƣớc 8: Thêm 20 µl muối Sodium acetate 3 M và 640 µl Ethanol 100%, trộn đều và để –200C trong 30 phút.
Bƣớc 9: Ly tâm 10 phút 14000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 µl TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở 40 C.
3.4.4.2. Quy trình ly trích DNA bằng nitơ lỏng
Bƣớc1 : Nghiền 0,3 g lá trong nitơ lỏng và cho vào eppendort 1,5 ml. Bƣớc 2 : Cho 1,3 ml dịch EB đã đƣợc ủ nóng ở 650
C vào eppendort rồi vortex thật kỹ.
Bƣớc 3 : Mẫu đƣợc ủ trong 1 giờ ở 650C và sau đó ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 100C, hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.
Bƣớc 4 : Sau đó cho 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) đảo nhẹ và lắc đều.
Bƣớc 5 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 100C, hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.
Bƣớc 6 : Cho tiếp 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) đảo nhẹ và lắc đều ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.
Bƣớc 7 : Cho 300 µl Isopropanol lạnh và ủ 1 giờ ở -200
C (nên để qua đêm). Bƣớc 8 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 9 : Cho 300 µl TE 1X ủ 370
C trong 1 giờ, sau đó cho tiếp 20 µl Sodium acetate và 640 µl Ethanol 100% để tủa 30 phút ở -200
C.
Bƣơc 10 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 11 : Rửa tủa với 400 µl Ethanol 70%, ly tâm 11000 vòng/phút trong 5
phút ở 40C, lập lại 1 lần nữa. Phơi mẫu 370C sau đó cho 100 µl TE 1X vào ủ 370C trong 30 phút.
Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu 40 C.
3.4.4.3. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
Để định tính DNA, điện di các mẫu DNA đã ly trích trên gel agarose. Trong điện trƣờng, DNA di chuyển từ điện cực âm sang điện cực dƣơng, vì DNA mang điện âm (do tính chất của nhóm phosphate). Khi DNA di chuyển qua các lỗ của gel agarose, sự cọ sát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh. Do đó, DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy, có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose dựa vào kích thƣớc phân tử.
Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA đƣợc phân ra tùy theo trọng lƣợng phân tử. Mà có thể quan sát DNA bằng mắt nhờ kỹ thuật nhuộm màu với Ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV.
Cách tiến hành:
Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba cho agarose tan thật đều.
Đổ gel và chờ agarose đông.
Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 µl loading dye và 4 µl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút.
Nhuộm Ethidium bromide khoảng 15 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả.
3.4.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Trên nguyên tắc sự hấp thu ánh sáng khác nhau của các base nitơ của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn, có thể xác định hàm lƣợng của DNA trong dung dịch. Giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm (OD260nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Đồng thời để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch DNA thƣờng đo giá trị OD280nm. Do protein có phổ hấp thụ cao nhất ở bƣớc sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm gây nên sự sai lệch khi tính nồng độ của acid nucleic. Khi giá trị OD260/OD280 = 1,8 – 2,2 thì dịch trích DNA đƣợc coi là tinh sạch.
Hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức:
DNA (ng/µl) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * Độ pha loãng Cách tiến hành:
Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn.
Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X. Hút 5 µl dung dịch DNA hòa tan với 495 µl TE 1X. Cho vào Curvette. Tiến hành đo OD.
DNA sau khi tách chiết và kiểm tra định tính, định lƣợng sẽ đƣợc bảo quản ở -200C để dùng cho việc thực hiện phản ứng RAPD.
3.4.5. Thực hiện phản ứng RAPD-PCR 3.4.5.1. Primer sử dụng 3.4.5.1. Primer sử dụng
Những primer đƣợc sử dụng trong nghiên cứu.
Bảng 3.3. Danh sách những primer dùng trong nghiên cứu
Tên primer Trình tự Tm OPA10 GTGATCGCAG 30,7 OPA5 AGGGGTCTTG 30,2 OPD18 GAGAGCCAAC 31,9 Primer 1 TGCCGAGCTG 40,7 OPAC10 AGCAGCGAGG 34 3.4.5.2. Bố trí thí nghiệm
Chọn những mẫu có độ tinh sạch cao để thực hiện phản ứng RAPD-PCR.
Thí nghiệm 1:
Mục đích: Chúng tôi khảo sát mồi, xem xét những mồi nào thích hợp cho phản ứng RAPD-PCR.
Bàng 3.4. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 Hóa chất Dung dịch gốc L hút Nđ cuối
PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X
MgCl2 25 mM 3 µl 3 mM
Primer 100 pM/µl 0,3 µl 1,2 pM/µl
dNTP 25 mM 0,2 µl 0,2 mM
Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,2 µl 1 U
DNA mẫu 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl
Nƣớc 17,8 µl
Bảng 3.5. Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 1 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 5 45 94 0,5 Ta 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002) Chỉ tiêu đánh giá: Các band DNA trên gel điện di.
Thí nghiệm 2:
Mục đích: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ primer đến qui trình RAPD-PCR. Phƣơng pháp tiến hành: Theo quy trình sau.
Bảng 3.6: Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD–PCR của thí nghiệm 2 Thành phần hóa chất Dung dịch gốc
Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3
L hút Nđ cuối L hút Nđ cuối L hút Nđ cuối
PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X 2,5 µl 1X 2,5 µl 1 X MgCl2 25 mM 3 µl 3 mM 3 µl 3mM 3 µl 3 mM Primer 100 pM/µl 0,25 µl 1 pM/µl 0,2 µl 0,8 pM/µl 0,15 µl 0,6 pM/µl dNTP 25 mM 0,2 µl 0,2 mM 0,2 µl 0,2 mM 0,2 µl 0,2 mM Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,2 µl 1 U 0,2 µl 1 U 0,2 µl 1 U DNA mẫu 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl 1 µl 20 ng/µl Nƣớc 17,85 µl 18,1 µl 17,95 µl
Bảng 3.7: Chƣơng trình nhiệt của phản ứng RAPD–PCR cho thí nghiệm 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 5 45 94 0,5 36 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002) Chỉ tiêu đánh giá: Các band DNA trên gel điện di.
Thí nghiệm 3:
Mục đích: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ MgCl2 và primer đến phản ứng RAPD - PCR.
Phƣơng pháp tiến hành: Theo quy trình sau.
Bảng 3.8: Bảng hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR của thí nghiệm 3 Nghiệm thức Hóa chất Dung dịch gốc L hút Nđ cuối Nghiệm thức 1 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2,5 µl 0,2 µl 2,5 mM 0,8 pM/µl Nghiệm thức 2 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2 µl 0,2 µl 2 mM 0,8 pM/µl Nghiệm thức 3 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2,5 µl 0,15 µl 2,5 mM 0,6 pM/µl Nghiệm thức 4 MgCl2 Primer 25 mM 100 µl 2 µl 0,15 µl 2 mM 0,6 pM/µl
Bảng 3.9: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD–PCR của thí nghiệm 3 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 5 45 94 0,5 36 0,5 72 1 1 72 5 Giữ sản phẩm RAPD-PCR ở 40 C (Nguyễn Thị Lang, 2002) Chỉ tiêu đánh giá: Số lƣợng và chất lƣợng các band DNA trên gel điện di.
Thí nghiệm 4
Mục đích: Dùng RAPD-PCR để nghiên cứu sự đa dạng cây mắm đen. Phƣơng pháp tiến hành: Theo qui trình sau.
Bảng 3.10. Thành phần hóa chất cho RAPD-PCR của thí nghiệm 4 Hóa chất Dung dịch gốc L hút N đ cuối
PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X
MgCl2 25 mM 2,5 µl 2,5 mM
Primer 100 pM/µl 0,15 µl 0,6 pM/µl
dNTP 25 mM 0,2 µl 0,2 mM