Chất bổ trợ kết hợp với kháng nguyên làm tăng cƣờng hiệu quả của đáp ứng miễn dịch cho cá. Chất bổ trợ Freund hoàn toàn và không hoàn toàn, dầu khoáng và lipopolysaccharide đã đƣợc sử dụng để tăng cƣờng khả năng sản xuất kháng thể.
Hiện nay, chất bổ trợ dầu khoáng đƣợc sử dụng có hiệu quả với vacxin đƣợc chế tạo từ kháng nguyên Aeromonas salmonicide và vacxin đa giá có sự kết hợp 3 kháng nguyên Vibrio spp., Yersinia sp., A. Salmonicide. Chất bổ trợ này có tác dụng giữ kháng nguyên lại dƣới dạng hạt và sau đó giải phóng kháng nguyên từ từ ngay vùng bụng (Anderson, 1997). Theo nghiên cứu của Tyler và Klesius (1994), chất bổ trợ nhũ dầu tiêm vào xoang bụng của cá nheo Ictalurus punctatus làm giảm khả năng đề kháng với vi khuẩn Ed. ictaluri và có thể gây ra một số phản ứng phụ.
Sự kết hợp giữa kháng nguyên và chất bổ trợ phèn chua bằng phƣơng pháp truyền thống khác nhau đƣợc sử dụng cho A. salmonicide, Y. ruckeri với kết quả khác nhau. Theo Udey và Fryer (1984), hỗn hợp phèn chua đã đƣợc sử dụng làm chất bổ trợ với vacxin kháng Vibrioisis bằng phƣơng pháp ngâm giúp gia tăng tiếp thu kháng nguyên, nên đƣợc xem là có ý nghĩa trong việc gia tăng đáp ứng miễn
dịch cho cá. Tuy nhiên, các nghiên cứu về sử dụng chất này để làm chất bổ trợ trong các loại vacxin cho cá hiện vẫn còn ít (Trích dẫn Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004).
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Từ tháng 3 đến tháng đầu tháng 6 năm 2007 tại Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nƣớc Ngọt Nam Bộ, Viện NC NTTS II.
Từ cuối tháng 6 đến đầu tháng 8 năm 2007 tại Phòng vi khuẩn, Phòng sinh học phân tử thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện NC NTTS II.
3.2 Vật liệu, Dụng cụ, Hóa chất 3.2.1 Vật liệu 3.2.1 Vật liệu
1/ Mẫu cá giống
Cá giống gồm 966 con khoảng hai tháng tuổi, sạch bệnh, có kích cỡ từ 40 – 60 g đƣợc sản xuất và nuôi trong môi trƣờng tốt nhất tại Trung Tâm Quốc Gia Giống Thuỷ Sản Nƣớc Ngọt Nam Bộ (trực thuộc Viện NC NTTS II).
2/ Vi khuẩn
Ba chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập tại ba địa điểm khác nhau xảy ra vào thời điểm dịch bệnh, cá thu mẫu có những dấu hiệu bệnh tích điển hình nhƣ bơi lờ đờ, bỏ ăn, xuất huyết các vây và gốc vây; bên trong gan, thận, lách có nhiều đốm trắng nhỏ.
Trong đó chủng vi khuẩn EI151 đã đƣợc phân lập, định danh (test sinh hoá, PCR) và xác định liều gây chết 50% (LD50) trên cá thí nghiệm là 22.500 tbvk/cá
(tƣơng đƣơng 2,25 x104
Bảng 3. 1. Ba chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập ở các thời điểm khác nhau
Lô Kí hiệu Triệu chứng lâm sàng Địa điểm Ngày thu
A Ei-23
Phân lập từ gan cá tra (57 – 60g). Cá bỏ ăn, mang bị trắng; bên trong máu có màu hồng nhạt, gan có đốm, thận không sƣng.
Vĩnh Long 11/2/2006
B Ei-151
Phân lập từ thận cá tra (chiều dài thân khoảng 24 cm).
Cá bỏ ăn, bơi lờ đờ, vây, thân xuất huyết, gan và thận có mủ trắng.
Đồng Tháp 21/6/2006
C Ei-338
Phân lập từ lách cá tra.
Cá bỏ ăn, xuất huyết các vây và gốc vây, thận có mủ.
Đồng Tháp 11/8/2006
3/ Thức ăn:
Thức ăn cho cá dạng viên nổi, là sản phẩm của công ty Uni-President (Đài Loan) và công ty Thức Ăn Thủy Sản Seafood (An Giang).
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị - dụng cụ cho gây nhiễm thực nghiệm: Bể xi măng, Máy sục khí;
Các bể kính dung tích 200L, vợt, lƣới, xô,... Cân phân tích, Bơm tiêm, Kéo, Kẹp, Ðèn cồn.
Các thiết bị - dụng cụ cho phân tích mẫu: Kính hiển vi; Tủ lạnh; Máy lắc
(Stuart Scientific); Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen); Đĩa petri; Que cấy; Bình tam giác; Ống nghiệm; Ðĩa microplate 96 giếng (dạng hình chữ "U"); Pipetman và pipette.
3.2.3 Hoá chất
- Dung dịch formalin 36 %; Dung dịch formol 0,4 % (Merck)
- Thuốc gây mê cá (Ethylenglycol monophenylether – C2H10O2)(Merck)
- Các chất bổ trợ: Montanide ISA 70 M-PG (Seppic, Pháp); Phèn chua (Merck,
Mỹ).
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trƣờng nƣớc thịt (NAVETCO); Môi trƣờng
thạch máu (gồm môi trƣờng tổng hợp thƣơng mại và 7% máu cừu).
- Hóa chất khác: Nƣớc cất vô trùng; Cồn 96o và 70o; Nƣớc muối sinh lý 0,85%.
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị cá 3.3.1 Chuẩn bị cá
Vệ sinh bể, bắt cá vào bể từ năm đến bảy ngày trƣớc khi làm thí nghiệm. Cá trƣớc khi đƣa vào bể phải đƣợc cân và đo để chọn đàn cá tƣơng đối đồng nhất khi làm thí nghiệm.
Thí nghiệm đƣợc bố trí trong điều kiện nhiệt độ môi trƣờng nƣớc khoảng 28 -
30oC, hệ thống lọc nƣớc hoạt động liên tục, cho cá ăn thức ăn viên nổi hai lần/ngày
vào lúc 6h và 17h, mỗi tuần thay bông lọc một lần cho máy lọc nƣớc.
3.3.2 Chuẩn bị vacxin
Nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn từ các ống đông khô ria lên các đĩa thạch máu
7%, nuôi cấy từ 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC. Chọn khuẩn lạc to, đẹp, đứng riêng
lẻ cho vào bình cầu chứa 250 ml nƣớc thịt dinh dƣỡng, nuôi cấy trên máy lắc trong
vòng 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC, đo độ đục và đếm để xác định số lƣợng vi
khuẩn.
Bất hoạt vi khuẩn: Vô hoạt huyền dịch này bằng dung dịch formol với tỉ lệ
0,4 % trong 48 giờ ở nhiệt độ 4oC. Để kiểm tra lại vi khuẩn có hoàn toàn bị bất hoạt
hay không, ta cấy vi khuẩn mới bất hoạt lên môi trƣờng thạch máu, nếu vi khuẩn không mọc, ta kết luận vi khuẩn đã bị bất hoạt.
Thêm chất bổ trợ: Trộn dung dịch chất bổ trợ (theo hƣớng dẫn của nhà sản
xuất) với canh khuẩn vô hoạt sao cho 0,2 ml vacxin chứa 108
, 109 và 3x109 tế bào vi khuẩn (TBVK).
Vaxcin không có chất bổ trợ
Vaxcin với chất bổ trợ Montanide ISA 70 M-PG (70% chất bổ trợ và
30% tế bào vi khuẩn) dạng nhũ dầu.
Vaxcin với chất bổ trợ phèn chua 0,4%: sử dụng phèn chua tinh khiết
pha với nƣớc cất tạo ra dung dịch 20%. Tiếp tục tổ hợp huyền dịch vi khuẩn đã bất hoạt với dung dịch phèn chua 20% với tỉ lệ 50:1. Hấp tiệt trùng ở 116oC trong 30 phút.
3.3.3 Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn sống
Vi khuẩn từ ống đông khô ria lên các đĩa thạch máu, nuôi cấy từ 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC.
Chọn khuẩn lạc to, đẹp, đứng riêng lẻ cho vào bình tam giác chứa 100 ml
nƣớc thịt dinh dƣỡng, nuôi cấy ở 28 - 30oC trong vòng 36 - 48 giờ. Trƣớc khi sử
dụng pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý vô trùng ở độ pha loãng 10-2. Công cho cá
với liều 0,2 ml/con (nếu nuôi vi khuẩn ở 28 - 30oC từ 36 - 48 giờ trong nƣớc thịt
dinh dƣỡng thì nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 5x108
CFU/ml). Ở độ pha loãng 10-2 thì
0,2 ml chứa khoảng 106 CFU.
Xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống:
Pha loãng sáu lần theo hệ số 10 từ huyền dịch trên (100) để thành các dung
dịch có độ pha loãng nhƣ sau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 tƣơng ứng với các kí hiệu 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6.
Từ mỗi độ pha loãng trên hút 20 µl nhỏ giọt lên đĩa thạch máu 7% (lặp lại hai lần), để khô rồi ủ ở 30°C trong 2 ngày.
3.3.4 Phƣơng pháp gây nhiễm thực nghiệm
Cá đƣợc thuần trong bể kiếng từ bảy đến 10 ngày trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Gây nhiễm cho cá bằng cách tiêm vào xoang bụng. Tiêm cá với thể tích cố định là 0,2 ml/cá. Khi tiêm cá đƣợc gây mê bằng thuốc gây mê Ethylenglycol monophenylether nồng độ 0,17 ppm trong 2 – 3 phút. Dùng kim tiêm 1 ml tiêm trực
tiếp vào xoang bụng cá sao cho kim tiêm và cá tạo thành một góc 30o
(Hình 3.1).
Hình 3. 1. Thao tác tiêm cá 3.3.5 Phƣơng pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm
Sau khi gây nhiễm cá, theo dõi và ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể, nếu cá chết trong vòng 24 giờ sau khi tiêm thì chứng tỏ cá bị sốc do tiêm. Theo dõi biểu hiện cá sau hai đến ba ngày gây nhiễm: cá bơi lờ đờ, bơi không định hƣớng, cá bỏ ăn, gầy yếu,... ngoài ra xem cá có xuất huyết các vây và gốc vây; xuất huyết hậu môn, hốc mắt, mắt đỏ, viêm loét chỗ tiêm,... Khi cá chết, giải phẫu cá có những biểu hiện xuất huyết nội tạng dẫn tới chảy máu xoang bụng, ruột chứa dịch vàng, xoang bụng chứa dịch trắng xem biểu hiện của các cơ quan bên trong nhƣ thận trƣớc và sau, gan, lách sƣng, nhũn, thâm đen, có mủ.
3.3.6 Phƣơng pháp thu mẫu máu, mẫu vi khuẩn 1/ Thu mẫu máu: 1/ Thu mẫu máu:
Dùng kim tiêm 1 ml tiêm vào động mạch chủ lƣng, hƣớng kim nghiêng so với cá 30o, khi kim tiêm đụng xƣơng cá thì dừng lại, đƣa mũi kim lệch về phía
bụng, rút nhẹ pittông cho máu chảy lên (Hình 3.2). Lấy 0,6 ml máu/con cho vào eppendorf để lắng tách lớp, để qua đêm ở 4oC, rồi lấy phần huyết thanh cho vào
eppendorf mới, bảo quản huyết thanh ở -20oC.
Hình 3. 2. Thao tác lấy máu cá 2/ Thu mẫu vi khuẩn:
Khi cá lờ đờ, sắp chết, mổ khám và chọn những cá có dấu hiệu bệnh tích điển hình. Tiến hành lấy mẫu vi khuẩn bằng cách dùng kéo vô trùng cắt phần thận
hay gan, lách cho vào eppendorf vô trùng, giữ mẫu lạnh ở 4oC và chuyển về phòng
thí nghiệm để tiến hành phân lập, định danh vi khuẩn (Hình 3.3).
3.3.7 Phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể
Nguyên tắc: Phản ứng vi ngƣng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu thể hiện dƣới dạng các hạt nhìn thấy đƣợc. Phản ứng này đƣợc thực hiện trên phiến nhựa 96 giếng. Pha loãng dung dịch kích thích ngay trên các dãy vi giếng của phiến nhựa bằng dung dịch đệm PBS có 0,6% BSA, cho đồng nhất thể tích huyền dịch kháng nguyên, trộn đều để yên ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm. Sau đó quan sát trực tiếp hoặc bằng kính lúp: nếu có mạng ngƣng kết bao phủ đáy là phản ứng dƣơng tính (+), ngƣợc lại nếu kháng nguyên tụ xuống đáy giếng thành một lớp màu trắng là phản ứng âm tính (-).
Phƣơng pháp:
+ Chuẩn bị kháng thể: huyết thanh đƣợc xử lí bằng cách đun cách thủy 56oC/32 phút để bất hoạt bổ thể.
+ Chuẩn bị kháng nguyên: vi khuẩn từ ống thạch nghiêng đã nuôi cấy 36 -
48h ở 28 - 30oC trộn với 5 ml nƣớc muối sinh lí trong ống nghiệm, đun ở 100oC/1h.
Pha loãng 50 µl huyền dịch vi khuẩn sống bằng nƣớc muối sinh lí 0,85% NaCl có 0,5 % formaline, nồng độ vi khuẩn bây giờ khoảng 108 - 109 tbvk/ml.
Các bƣớc tiến hành:
- Hút 50 µl dung dịch PBS 0,6% BSA vào các giếng từ hai đến 12 (Hình 3.4).
- Giếng thứ nhất, gồm 90 µl dung dịch PBS 0,6% BSA và 10 µl huyết thanh, độ
pha loãng của huyết thanh là 1:10, trộn đều.
- Sau đó, hút 50 µl dung dịch từ giếng thứ nhất chuyển lần lƣợt qua các giếng đến
giếng 11 thì bỏ dung dịch này (không cho qua giếng 12 là giếng đối chứng). Nhƣ thế ta đã pha loãng bậc hai liên tiếp huyết thanh từ độ pha loãng đầu tiên. Giếng 12 chỉ có 50 µl PBS 0,6% BSA (không có huyết thanh).
- Cho 50 µl huyền dịch vi khuẩn vào các giếng. Gõ nhẹ bốn cạnh của phiến nhựa
để trộn đều hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể. Ủ 2 giờ ở 37oC, sau đó ủ qua
- Quan sát hiện tƣợng ngƣng kết. Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A H PBS (µl) 90 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Huyết thanh(µl) 10 50 Vi khuẩn(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Hình 3. 4. Sơ đồ cụ thể hóa các bƣớc tiến hành phản ứng vi ngƣng kết 3.3.8 Phƣơng pháp xử lý thống kê
Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng trắc nghiệm F của phần mềm statgraphic 7.0.
3.4 Bố trí thí nghiệm
3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu
Mục tiêu của thí nghiệm này là nhằm xác định khả năng sử dụng của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG của Seppic.
- Bố trí sử dụng ba loại vacxin A, B, C tƣơng ứng với chủng vi khuẩn kí hiệu lần lƣợt là Ei-23, Ei-151, Ei-338 (Bảng 3.2). Mỗi loại vacxin gồm bốn nghiệm thức, ba nghiệm thức sử dụng vacxin ứng với ba nồng độ 108, 109, 3 x 109 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức đối chứng sử dụng nƣớc muối sinh lí. Mỗi nghiệm thức tƣơng ứng với hai bể, gồm 42 cá thí nghiệm. Tổng số là 24 bể, 504 cá, trọng lƣợng trung bình của cá là 43,39 g.
- Thời gian thí nghiệm: Ngày thứ nhất tiêm ba loại vacxin lần lƣợt cho từng nghiệm thức sử dụng vacxin và tiêm nƣớc muối sinh lí cho các nghiệm thức đối
chứng; Ngày thứ 14 tiêm vacxin và nƣớc muối sinh lí nhắc lại. Ngày thứ 21 công vi khuẩn sống cho nghiệm thức sử dụng vacxin và nghiệm thức đối chứng (khi tiêm vacxin loại nào thì công vi khuẩn loại đó). Sau đó, tiếp tục theo dõi cá đến ngày thứ 42. Theo dõi và mô tả lại các dấu hiệu bệnh tích, thống kê số lƣợng cá sống và chết để tính tỉ lệ bảo hộ.
Hình 3. 5. Hệ thống bố trí bể kính thí nghiệm
Bảng 3. 2. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG
Nồng độ vacxin (tbvk/cá)
Loại vacxin
A B C
108 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2
109 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2
3x109 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2
Nƣớc SL 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2
3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn
Mục đích của thí nghiệm này nhằm kiểm tra lại độc lực của ba chủng vi khuẩn Ei-23, Ei-151, Ei-338 đã đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 1.
- Bố trí thí nghiệm: sử dụng ba chủng vi khuẩn nêu trên công cá với nồng độ công vi kuẩn (xem Bảng 3.3). Mỗi nghiệm thức gồm 18 cá, vậy tổng số cá sử dụng là 54 cá với trọng lƣợng trung bình là 64,90 g.
- Thời gian thí nghiệm trong vòng bảy đến 10 ngày. Theo dõi cá trong suốt quá trình thí nghiệm, mô tả bệnh tích, tổng kết số cá chết.
Bảng 3. 3. Bố trí thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn
Loại vi khuẩn Nồng độ vi khuẩn
(tbvk/cá) Số cá thí nghiệm A 2,5 x106 (110 LD50) 18 con B 2 x106 (90 LD50) 18 con C 5,6 x105 (25 LD50) 18 con
Ghi chú: A: Ei-23, B: Ei-151, C: Ei-338
3.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua
Thí nghiệm đƣợc bố trí nhằm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ phèn chua (Merck) đối với hai chủng vi khuẩn Ei-23 và Ei-151 tƣơng ứng với hai loại vacxin A và B. Riêng đối với chủng Ei-151, chúng tôi dùng thêm vacxin không có chất bổ trợ để so sánh với vacxin có sử dụng chất bổ trợ phèn chua. Mẫu huyết thanh của cá đƣợc thu để xác định hiệu giá kháng thể nhằm đánh giá hiệu quả của vacxin.
- Thí nghiệm gồm hai nhóm vacxin thuộc hai chủng vi khuẩn Ed. ictaluri:
vacxin B1 vacxin có chất bổ trợ, B2 vacxin không có chất bổ trợ, A1 vacxin không
109, 3 x 109 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức cá đối chứng đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lí (trong thí nghiệm này hai loại vacxin B1, B2 chỉ sử dụng một nghiệm thức đối chứng). Mỗi nghiệm thức tƣơng ứng gồm 42 cá cho hai bể; thí nhgiệm sử dụng 22