Cá đƣợc thuần trong bể kiếng từ bảy đến 10 ngày trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Gây nhiễm cho cá bằng cách tiêm vào xoang bụng. Tiêm cá với thể tích cố định là 0,2 ml/cá. Khi tiêm cá đƣợc gây mê bằng thuốc gây mê Ethylenglycol monophenylether nồng độ 0,17 ppm trong 2 – 3 phút. Dùng kim tiêm 1 ml tiêm trực
tiếp vào xoang bụng cá sao cho kim tiêm và cá tạo thành một góc 30o
(Hình 3.1).
Hình 3. 1. Thao tác tiêm cá 3.3.5 Phƣơng pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm
Sau khi gây nhiễm cá, theo dõi và ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể, nếu cá chết trong vòng 24 giờ sau khi tiêm thì chứng tỏ cá bị sốc do tiêm. Theo dõi biểu hiện cá sau hai đến ba ngày gây nhiễm: cá bơi lờ đờ, bơi không định hƣớng, cá bỏ ăn, gầy yếu,... ngoài ra xem cá có xuất huyết các vây và gốc vây; xuất huyết hậu môn, hốc mắt, mắt đỏ, viêm loét chỗ tiêm,... Khi cá chết, giải phẫu cá có những biểu hiện xuất huyết nội tạng dẫn tới chảy máu xoang bụng, ruột chứa dịch vàng, xoang bụng chứa dịch trắng xem biểu hiện của các cơ quan bên trong nhƣ thận trƣớc và sau, gan, lách sƣng, nhũn, thâm đen, có mủ.
3.3.6 Phƣơng pháp thu mẫu máu, mẫu vi khuẩn 1/ Thu mẫu máu: 1/ Thu mẫu máu:
Dùng kim tiêm 1 ml tiêm vào động mạch chủ lƣng, hƣớng kim nghiêng so với cá 30o, khi kim tiêm đụng xƣơng cá thì dừng lại, đƣa mũi kim lệch về phía
bụng, rút nhẹ pittông cho máu chảy lên (Hình 3.2). Lấy 0,6 ml máu/con cho vào eppendorf để lắng tách lớp, để qua đêm ở 4oC, rồi lấy phần huyết thanh cho vào
eppendorf mới, bảo quản huyết thanh ở -20oC.
Hình 3. 2. Thao tác lấy máu cá 2/ Thu mẫu vi khuẩn:
Khi cá lờ đờ, sắp chết, mổ khám và chọn những cá có dấu hiệu bệnh tích điển hình. Tiến hành lấy mẫu vi khuẩn bằng cách dùng kéo vô trùng cắt phần thận
hay gan, lách cho vào eppendorf vô trùng, giữ mẫu lạnh ở 4oC và chuyển về phòng
thí nghiệm để tiến hành phân lập, định danh vi khuẩn (Hình 3.3).
3.3.7 Phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể
Nguyên tắc: Phản ứng vi ngƣng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu thể hiện dƣới dạng các hạt nhìn thấy đƣợc. Phản ứng này đƣợc thực hiện trên phiến nhựa 96 giếng. Pha loãng dung dịch kích thích ngay trên các dãy vi giếng của phiến nhựa bằng dung dịch đệm PBS có 0,6% BSA, cho đồng nhất thể tích huyền dịch kháng nguyên, trộn đều để yên ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm. Sau đó quan sát trực tiếp hoặc bằng kính lúp: nếu có mạng ngƣng kết bao phủ đáy là phản ứng dƣơng tính (+), ngƣợc lại nếu kháng nguyên tụ xuống đáy giếng thành một lớp màu trắng là phản ứng âm tính (-).
Phƣơng pháp:
+ Chuẩn bị kháng thể: huyết thanh đƣợc xử lí bằng cách đun cách thủy 56oC/32 phút để bất hoạt bổ thể.
+ Chuẩn bị kháng nguyên: vi khuẩn từ ống thạch nghiêng đã nuôi cấy 36 -
48h ở 28 - 30oC trộn với 5 ml nƣớc muối sinh lí trong ống nghiệm, đun ở 100oC/1h.
Pha loãng 50 µl huyền dịch vi khuẩn sống bằng nƣớc muối sinh lí 0,85% NaCl có 0,5 % formaline, nồng độ vi khuẩn bây giờ khoảng 108 - 109 tbvk/ml.
Các bƣớc tiến hành:
- Hút 50 µl dung dịch PBS 0,6% BSA vào các giếng từ hai đến 12 (Hình 3.4).
- Giếng thứ nhất, gồm 90 µl dung dịch PBS 0,6% BSA và 10 µl huyết thanh, độ
pha loãng của huyết thanh là 1:10, trộn đều.
- Sau đó, hút 50 µl dung dịch từ giếng thứ nhất chuyển lần lƣợt qua các giếng đến
giếng 11 thì bỏ dung dịch này (không cho qua giếng 12 là giếng đối chứng). Nhƣ thế ta đã pha loãng bậc hai liên tiếp huyết thanh từ độ pha loãng đầu tiên. Giếng 12 chỉ có 50 µl PBS 0,6% BSA (không có huyết thanh).
- Cho 50 µl huyền dịch vi khuẩn vào các giếng. Gõ nhẹ bốn cạnh của phiến nhựa
để trộn đều hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể. Ủ 2 giờ ở 37oC, sau đó ủ qua
- Quan sát hiện tƣợng ngƣng kết. Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A H PBS (µl) 90 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Huyết thanh(µl) 10 50 Vi khuẩn(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Hình 3. 4. Sơ đồ cụ thể hóa các bƣớc tiến hành phản ứng vi ngƣng kết 3.3.8 Phƣơng pháp xử lý thống kê
Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng trắc nghiệm F của phần mềm statgraphic 7.0.
3.4 Bố trí thí nghiệm
3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu
Mục tiêu của thí nghiệm này là nhằm xác định khả năng sử dụng của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG của Seppic.
- Bố trí sử dụng ba loại vacxin A, B, C tƣơng ứng với chủng vi khuẩn kí hiệu lần lƣợt là Ei-23, Ei-151, Ei-338 (Bảng 3.2). Mỗi loại vacxin gồm bốn nghiệm thức, ba nghiệm thức sử dụng vacxin ứng với ba nồng độ 108, 109, 3 x 109 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức đối chứng sử dụng nƣớc muối sinh lí. Mỗi nghiệm thức tƣơng ứng với hai bể, gồm 42 cá thí nghiệm. Tổng số là 24 bể, 504 cá, trọng lƣợng trung bình của cá là 43,39 g.
- Thời gian thí nghiệm: Ngày thứ nhất tiêm ba loại vacxin lần lƣợt cho từng nghiệm thức sử dụng vacxin và tiêm nƣớc muối sinh lí cho các nghiệm thức đối
chứng; Ngày thứ 14 tiêm vacxin và nƣớc muối sinh lí nhắc lại. Ngày thứ 21 công vi khuẩn sống cho nghiệm thức sử dụng vacxin và nghiệm thức đối chứng (khi tiêm vacxin loại nào thì công vi khuẩn loại đó). Sau đó, tiếp tục theo dõi cá đến ngày thứ 42. Theo dõi và mô tả lại các dấu hiệu bệnh tích, thống kê số lƣợng cá sống và chết để tính tỉ lệ bảo hộ.
Hình 3. 5. Hệ thống bố trí bể kính thí nghiệm
Bảng 3. 2. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG
Nồng độ vacxin (tbvk/cá)
Loại vacxin
A B C
108 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2
109 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2
3x109 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2
Nƣớc SL 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2
3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn
Mục đích của thí nghiệm này nhằm kiểm tra lại độc lực của ba chủng vi khuẩn Ei-23, Ei-151, Ei-338 đã đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 1.
- Bố trí thí nghiệm: sử dụng ba chủng vi khuẩn nêu trên công cá với nồng độ công vi kuẩn (xem Bảng 3.3). Mỗi nghiệm thức gồm 18 cá, vậy tổng số cá sử dụng là 54 cá với trọng lƣợng trung bình là 64,90 g.
- Thời gian thí nghiệm trong vòng bảy đến 10 ngày. Theo dõi cá trong suốt quá trình thí nghiệm, mô tả bệnh tích, tổng kết số cá chết.
Bảng 3. 3. Bố trí thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn
Loại vi khuẩn Nồng độ vi khuẩn
(tbvk/cá) Số cá thí nghiệm A 2,5 x106 (110 LD50) 18 con B 2 x106 (90 LD50) 18 con C 5,6 x105 (25 LD50) 18 con
Ghi chú: A: Ei-23, B: Ei-151, C: Ei-338
3.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua
Thí nghiệm đƣợc bố trí nhằm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ phèn chua (Merck) đối với hai chủng vi khuẩn Ei-23 và Ei-151 tƣơng ứng với hai loại vacxin A và B. Riêng đối với chủng Ei-151, chúng tôi dùng thêm vacxin không có chất bổ trợ để so sánh với vacxin có sử dụng chất bổ trợ phèn chua. Mẫu huyết thanh của cá đƣợc thu để xác định hiệu giá kháng thể nhằm đánh giá hiệu quả của vacxin.
- Thí nghiệm gồm hai nhóm vacxin thuộc hai chủng vi khuẩn Ed. ictaluri:
vacxin B1 vacxin có chất bổ trợ, B2 vacxin không có chất bổ trợ, A1 vacxin không
109, 3 x 109 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức cá đối chứng đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lí (trong thí nghiệm này hai loại vacxin B1, B2 chỉ sử dụng một nghiệm thức đối chứng). Mỗi nghiệm thức tƣơng ứng gồm 42 cá cho hai bể; thí nhgiệm sử dụng 22 bể, 462 cá, trọng lƣợng cá trung bình là 63,39 g.
- Thời gian thí nghiệm (28 ngày): Ngày thứ nhất tiêm ba loại vacxin lần lƣợt cho từng nghiệm thức sử dụng vacxin, tiêm nƣớc muối sinh lí cho các nghiệm thức đối chứng. Ngày thứ 14 tiêm vacxin và nƣớc muối sinh lí nhắc lại. Ngày thứ 21 công vi khuẩn sống cho nghiệm thức sử dụng vacxin và nghiệm thức đối chứng của từng loại vacxin (khi tiêm vacxin loại nào thì công vi khuẩn loại đó) với liều 0,2 ml/con và nồng độ công vi khuẩn (xem Bảng 4.5). Ngày thứ 28 kết thúc thí nghiệm.
- Theo dõi cá trong suốt quá trình thí nghiệm, mô tả dấu hiệu bệnh tích, thống kê số lƣợng cá sống và chết để tính tỉ lệ bảo hộ.
- Thu mẫu huyết thanh các thí nghiệm vào ngày thứ nhất trƣớc khi tiêm vacxin, vào ngày 21 trƣớc khi công vi khuẩn sống và ngày 28 khi kết thúc thí nghiệm.
- Thu mẫu vi khuẩn: sau khi công vi khuẩn sống cho cá, thu mẫu vi khuẩn đối với những cá chết có dấu hiệu bệnh đốm trắng điển hình nhƣ bên ngoài xuất huyết các vây và gốc vây nặng, bên trong thận, gan, lách có nhiều đốm trắng.
Bảng 3. 4. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ phèn chua
Nồng độ vacxin (tbvk/cá)
Loại vacxin
B1 B2 A1 108 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 109 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 3x109 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 Nƣớc SL 21 con x 2 21 con x 2
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Bảng 4. 1. Thí nghiệm 1: Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí
nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức
Loại vacxin Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Số cá thí nghiệm (x 2 bể) Số cá chết qua các ngày Số cá chết Số cá còn lại Tỉ lệ cá chết (%) 1-14 14-21 21-38 A 108 42 4 3 9 16 26 38,1 109 42 7 7 14 28 33,33 3x109 42 1 1 41 2,38 ĐC 42 0 42 0 B 108 42 1 2 3 39 7,14 109 42 1 1 2 40 4,76 3x109 42 0 42 0 ĐC 42 0 42 0 C 108 42 1 1 41 2,38 109 42 6 1 2 9 33 21,43 3x109 42 1 1 41 2,38 ĐC 42 0 42 0
Bảng 4. 2. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 1
Thời gian Biểu hiện bệnh lý
Ngày 1- 14 Ngày thứ 1: tiêm vacxin, cá biểu hiện bình thƣờng.
Ngày thứ 2 – 5: cá hoạt động bình thƣờng.
Ngày thứ 6: cá bắt đầu chết ở nghiệm thức 108 lô A với biểu
hiện bên ngoài toàn thân mất màu từng mảng, da có rất nhiều nhớt; bên trong thận sƣng mất màu, gan và lách teo nhỏ, xoang bụng chứa đầy dịch trắng.
Ngày thứ 7 – 10: cá chết rải rác ở các nghiệm thức 108 lô A,
109 lô C với những biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ sáu. Ngày thứ
10, lúc 16h30 kiểm tra cá ở nghiệm thức 108 lô A và nghiệm thức
109 lô C chúng tôi quan sát thấy bề ngoài của các cá đƣợc kiểm tra
toàn thân phủ nhiều vết chấm trắng nhỏ, lấy mẫu quan sát dƣới kính hiển vi thấy có nhiều trùng bánh xe. Chúng tôi tiến hành tắm formol cho toàn bộ cá thí nghiệm với nồng độ 20 ppm, thời gian khử 5 phút, sau đó tháo cạn nƣớc còn 5 cm đóng van và cấp nƣớc mới vào. Ngày thứ 12: lúc 8h30 tắm formol cho toàn bộ cá thí nghiệm lần 2, nồng độ 20 ppm trong 5 phút.
Ngày thứ 11 - 13: cá hoạt động bình thƣờng.
Ngày 14 - 21 Ngày thứ 14: lúc 10h tiêm nhắc lại vacxin, sau khi tiêm nhắc
lại có ba cá chết do thao tác tiêm.
Ngày thứ 15: cá hoạt động bình thƣờng.
Ngày thứ 16: nghiệm thức 109 lô C có một cá chết biểu hiện
bên ngoài phồng ngay vùng bụng và ứ động máu (Hình 4.1); bên trong thận sƣng, gan và lách thâm đen, xoang bụng chứa đầy dung dịch màu trắng (Hình 4.2).
có biểu hiện bên ngoài cá gầy ốm, tƣa vây, hoại tử điểm tiêm; bên trong gan teo sậm màu, thận sƣng và nhũn, tụy teo, mạch máu vón cục, xoang bụng chứa đầy dịch trắng.
Ngày thứ 18 - 20: cá chết ở nghiệm thức 109 lô A có biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ 17.
Ngày 21 - 38 Ngày thứ 21: công vi khuẩn cho tất cả lô thí nghiệm. Trong
quá trình cảm nhiễm, ở các nghiệm thức 108, 109 lô A có một số cá
do quá nhỏ, gầy yếu, hoại tử vùng tiêm nên sẽ bị loại ra và không công vi khuẩn.
Ngày thứ 22: nghiệm thức 108 lô A có hai cá chết biểu hiện
giống nhau bên ngoài tƣa vây, thân gầy teo, viêm loét vùng tiêm; bên trong gan, thận và lách bị teo nhỏ, xoang bụng chứa đầy dịch trắng. Ngày thứ 23: nghiệm thức 108 lô A có một cá chết với biểu hiện nhƣ ngày thứ 22; nghiệm thức 109 lô A có một cá chết bên ngoài biểu hiện nhƣ trên bên trong đã xuất hiện đốm trắng nhẹ.
Ngày thứ 24 – 38: cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin có biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ 22, cho đến thời điểm này cá ở các nghiệm thức đối chứng không chết. Ngày thứ 38: Chúng tôi kết thúc thí nghiệm.
Hình 4. 1. Cá bị lở loét ngay vùng bụng
Hình 4. 2. Xoang bụng cá chứa đầy dịch trắng
Ở thí nghiệm 1, trƣớc khi tiêm vacxin cá khỏe và biểu hiện bình thƣờng. Nhƣng sau khi tiêm vacxin trong khoảng thời gian từ ngày thứ 6 – 10 các nghiệm thức tiêm vacxin cá chết do ký sinh trùng ngoài biểu hiện bệnh tích của ký sinh, cá còn có những biểu hiện khác nhƣ bên ngoài lở loét vùng bụng; bên trong xoang bụng có chứa đầy dịch trắng, trong khi các nghiệm thức đối chứng thì cá hoạt động bình thƣờng. Trong thí nghiệm này điều kiện môi trƣờng, nguồn nƣớc là nhƣ nhau ở tất cả các nghiệm thức, cá đối chứng hoạt động bình thƣờng, chỉ ở các nghiệm thức tiêm vacxin có cá chết với những triệu chứng nhƣ trên. Điều này chứng tỏ chất bổ trợ nhũ dầu làm vacxin đã gây tác dụng phụ, tạo cơ hội cho ký sinh trùng phát triển. Sau đó chúng tôi xử lí formol cho tất cả các nghiệm thức sau một ngày thì cá không còn dấu hiệu của ký sinh trùng và cá hoạt động bình thƣờng từ ngày thứ 10 – 13.
Vào ngày thứ 14 chúng tôi tiêm nhắc lại vacxin, sau một ngày cá có những triệu chứng bất thƣờng, cá chết rải rác ở các nghiệm thức tiêm vacxin với những biểu hiện bên ngoài cá gầy yếu, bỏ ăn, lở loét ngay vùng bụng; bên trong thận, gan và lách teo, thận sƣng mất màu, gan thâm đen, xoang bụng chứa đầy dịch trắng và cá tiếp tục chết ở các ngày sau đó với những triệu chứng đã nêu, một điều cần chú ý là tất cả các cá chết khi giải phẫu bên trong xoang bụng đều chứa dịch trắng; trong khi đó cá ở các nghiệm thức đối chứng hoạt động bình thƣờng và không có con nào chết. Nhƣ vậy trong điều kiện thí nghiệm nhƣ nhau đối với các nghiệm thức có sự khác biệt lớn giữa nghiệm thức tiêm vacxin và đối chứng: nghiệm thức đối chứng cá hoạt động bình thƣờng, nghiệm thức tiêm vacxin cá chết sau khi tiêm vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu, nhƣ thế có thể nói vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu đã tác động