Thí nghiệm đƣợc bố trí nhằm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ phèn chua (Merck) đối với hai chủng vi khuẩn Ei-23 và Ei-151 tƣơng ứng với hai loại vacxin A và B. Riêng đối với chủng Ei-151, chúng tôi dùng thêm vacxin không có chất bổ trợ để so sánh với vacxin có sử dụng chất bổ trợ phèn chua. Mẫu huyết thanh của cá đƣợc thu để xác định hiệu giá kháng thể nhằm đánh giá hiệu quả của vacxin.
- Thí nghiệm gồm hai nhóm vacxin thuộc hai chủng vi khuẩn Ed. ictaluri:
vacxin B1 vacxin có chất bổ trợ, B2 vacxin không có chất bổ trợ, A1 vacxin không
109, 3 x 109 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức cá đối chứng đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lí (trong thí nghiệm này hai loại vacxin B1, B2 chỉ sử dụng một nghiệm thức đối chứng). Mỗi nghiệm thức tƣơng ứng gồm 42 cá cho hai bể; thí nhgiệm sử dụng 22 bể, 462 cá, trọng lƣợng cá trung bình là 63,39 g.
- Thời gian thí nghiệm (28 ngày): Ngày thứ nhất tiêm ba loại vacxin lần lƣợt cho từng nghiệm thức sử dụng vacxin, tiêm nƣớc muối sinh lí cho các nghiệm thức đối chứng. Ngày thứ 14 tiêm vacxin và nƣớc muối sinh lí nhắc lại. Ngày thứ 21 công vi khuẩn sống cho nghiệm thức sử dụng vacxin và nghiệm thức đối chứng của từng loại vacxin (khi tiêm vacxin loại nào thì công vi khuẩn loại đó) với liều 0,2 ml/con và nồng độ công vi khuẩn (xem Bảng 4.5). Ngày thứ 28 kết thúc thí nghiệm.
- Theo dõi cá trong suốt quá trình thí nghiệm, mô tả dấu hiệu bệnh tích, thống kê số lƣợng cá sống và chết để tính tỉ lệ bảo hộ.
- Thu mẫu huyết thanh các thí nghiệm vào ngày thứ nhất trƣớc khi tiêm vacxin, vào ngày 21 trƣớc khi công vi khuẩn sống và ngày 28 khi kết thúc thí nghiệm.
- Thu mẫu vi khuẩn: sau khi công vi khuẩn sống cho cá, thu mẫu vi khuẩn đối với những cá chết có dấu hiệu bệnh đốm trắng điển hình nhƣ bên ngoài xuất huyết các vây và gốc vây nặng, bên trong thận, gan, lách có nhiều đốm trắng.
Bảng 3. 4. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ phèn chua
Nồng độ vacxin (tbvk/cá)
Loại vacxin
B1 B2 A1 108 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 109 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 3x109 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 Nƣớc SL 21 con x 2 21 con x 2
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Bảng 4. 1. Thí nghiệm 1: Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí
nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức
Loại vacxin Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Số cá thí nghiệm (x 2 bể) Số cá chết qua các ngày Số cá chết Số cá còn lại Tỉ lệ cá chết (%) 1-14 14-21 21-38 A 108 42 4 3 9 16 26 38,1 109 42 7 7 14 28 33,33 3x109 42 1 1 41 2,38 ĐC 42 0 42 0 B 108 42 1 2 3 39 7,14 109 42 1 1 2 40 4,76 3x109 42 0 42 0 ĐC 42 0 42 0 C 108 42 1 1 41 2,38 109 42 6 1 2 9 33 21,43 3x109 42 1 1 41 2,38 ĐC 42 0 42 0
Bảng 4. 2. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 1
Thời gian Biểu hiện bệnh lý
Ngày 1- 14 Ngày thứ 1: tiêm vacxin, cá biểu hiện bình thƣờng.
Ngày thứ 2 – 5: cá hoạt động bình thƣờng.
Ngày thứ 6: cá bắt đầu chết ở nghiệm thức 108 lô A với biểu
hiện bên ngoài toàn thân mất màu từng mảng, da có rất nhiều nhớt; bên trong thận sƣng mất màu, gan và lách teo nhỏ, xoang bụng chứa đầy dịch trắng.
Ngày thứ 7 – 10: cá chết rải rác ở các nghiệm thức 108 lô A,
109 lô C với những biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ sáu. Ngày thứ
10, lúc 16h30 kiểm tra cá ở nghiệm thức 108 lô A và nghiệm thức
109 lô C chúng tôi quan sát thấy bề ngoài của các cá đƣợc kiểm tra
toàn thân phủ nhiều vết chấm trắng nhỏ, lấy mẫu quan sát dƣới kính hiển vi thấy có nhiều trùng bánh xe. Chúng tôi tiến hành tắm formol cho toàn bộ cá thí nghiệm với nồng độ 20 ppm, thời gian khử 5 phút, sau đó tháo cạn nƣớc còn 5 cm đóng van và cấp nƣớc mới vào. Ngày thứ 12: lúc 8h30 tắm formol cho toàn bộ cá thí nghiệm lần 2, nồng độ 20 ppm trong 5 phút.
Ngày thứ 11 - 13: cá hoạt động bình thƣờng.
Ngày 14 - 21 Ngày thứ 14: lúc 10h tiêm nhắc lại vacxin, sau khi tiêm nhắc
lại có ba cá chết do thao tác tiêm.
Ngày thứ 15: cá hoạt động bình thƣờng.
Ngày thứ 16: nghiệm thức 109 lô C có một cá chết biểu hiện
bên ngoài phồng ngay vùng bụng và ứ động máu (Hình 4.1); bên trong thận sƣng, gan và lách thâm đen, xoang bụng chứa đầy dung dịch màu trắng (Hình 4.2).
có biểu hiện bên ngoài cá gầy ốm, tƣa vây, hoại tử điểm tiêm; bên trong gan teo sậm màu, thận sƣng và nhũn, tụy teo, mạch máu vón cục, xoang bụng chứa đầy dịch trắng.
Ngày thứ 18 - 20: cá chết ở nghiệm thức 109 lô A có biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ 17.
Ngày 21 - 38 Ngày thứ 21: công vi khuẩn cho tất cả lô thí nghiệm. Trong
quá trình cảm nhiễm, ở các nghiệm thức 108, 109 lô A có một số cá
do quá nhỏ, gầy yếu, hoại tử vùng tiêm nên sẽ bị loại ra và không công vi khuẩn.
Ngày thứ 22: nghiệm thức 108 lô A có hai cá chết biểu hiện
giống nhau bên ngoài tƣa vây, thân gầy teo, viêm loét vùng tiêm; bên trong gan, thận và lách bị teo nhỏ, xoang bụng chứa đầy dịch trắng. Ngày thứ 23: nghiệm thức 108 lô A có một cá chết với biểu hiện nhƣ ngày thứ 22; nghiệm thức 109 lô A có một cá chết bên ngoài biểu hiện nhƣ trên bên trong đã xuất hiện đốm trắng nhẹ.
Ngày thứ 24 – 38: cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin có biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ 22, cho đến thời điểm này cá ở các nghiệm thức đối chứng không chết. Ngày thứ 38: Chúng tôi kết thúc thí nghiệm.
Hình 4. 1. Cá bị lở loét ngay vùng bụng
Hình 4. 2. Xoang bụng cá chứa đầy dịch trắng
Ở thí nghiệm 1, trƣớc khi tiêm vacxin cá khỏe và biểu hiện bình thƣờng. Nhƣng sau khi tiêm vacxin trong khoảng thời gian từ ngày thứ 6 – 10 các nghiệm thức tiêm vacxin cá chết do ký sinh trùng ngoài biểu hiện bệnh tích của ký sinh, cá còn có những biểu hiện khác nhƣ bên ngoài lở loét vùng bụng; bên trong xoang bụng có chứa đầy dịch trắng, trong khi các nghiệm thức đối chứng thì cá hoạt động bình thƣờng. Trong thí nghiệm này điều kiện môi trƣờng, nguồn nƣớc là nhƣ nhau ở tất cả các nghiệm thức, cá đối chứng hoạt động bình thƣờng, chỉ ở các nghiệm thức tiêm vacxin có cá chết với những triệu chứng nhƣ trên. Điều này chứng tỏ chất bổ trợ nhũ dầu làm vacxin đã gây tác dụng phụ, tạo cơ hội cho ký sinh trùng phát triển. Sau đó chúng tôi xử lí formol cho tất cả các nghiệm thức sau một ngày thì cá không còn dấu hiệu của ký sinh trùng và cá hoạt động bình thƣờng từ ngày thứ 10 – 13.
Vào ngày thứ 14 chúng tôi tiêm nhắc lại vacxin, sau một ngày cá có những triệu chứng bất thƣờng, cá chết rải rác ở các nghiệm thức tiêm vacxin với những biểu hiện bên ngoài cá gầy yếu, bỏ ăn, lở loét ngay vùng bụng; bên trong thận, gan và lách teo, thận sƣng mất màu, gan thâm đen, xoang bụng chứa đầy dịch trắng và cá tiếp tục chết ở các ngày sau đó với những triệu chứng đã nêu, một điều cần chú ý là tất cả các cá chết khi giải phẫu bên trong xoang bụng đều chứa dịch trắng; trong khi đó cá ở các nghiệm thức đối chứng hoạt động bình thƣờng và không có con nào chết. Nhƣ vậy trong điều kiện thí nghiệm nhƣ nhau đối với các nghiệm thức có sự khác biệt lớn giữa nghiệm thức tiêm vacxin và đối chứng: nghiệm thức đối chứng cá hoạt động bình thƣờng, nghiệm thức tiêm vacxin cá chết sau khi tiêm vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu, nhƣ thế có thể nói vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu đã tác động không tốt tới hoạt động sống bình thƣờng của cá. Tuy nhiên, chúng tôi vẫn tiến hành công vi khuẩn sống cho cá đối chứng và cá tiêm vacxin để đánh giá thêm tác động của chất bổ trợ nhũ dầu lên tính mẫn cảm của cá đối với Ed. ictaluri. Khi công vi khuẩn sống cho tất cả các nghiệm thức vào ngày thứ 21, sau đó một ngày đã có cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin với những biểu hiện tƣơng tự nhƣ lúc đầu và tiếp tục có cá chết vào những ngày tiếp theo với những bệnh tích tƣơng tự nhƣng thêm vào đó là những dấu hiệu của bệnh đốm trắng nhẹ; một điều cần lƣu ý là tới lúc này, cá ở các nghiệm thức đối chứng vẫn hoạt động bình thƣờng. Trong khi ở các nghiệm thức tiêm vacxin lại tiếp tục có cá chết, nhƣ thế ta có thể thấy rõ là vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG ngoài việc gây chết cá khi nuôi bình thƣờng trong điều kiện thí nghiệm còn gây chết cá nhiều hơn (Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1) khi có sự xuất hiện của Ed. ictaluri. Nhƣng sau khi công cƣờng độc vi khuẩn, cá đối chứng vẫn không chết nên chúng tôi nghi ngờ về độc lực của vi khuẩn hoặc nồng độ vi khuẩn chƣa đạt mức cho cá chết nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm 2 để khẳng định lại vấn đề này.
Tỉ lệ cá chết thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu 38,1 7,14 21,43 2,38 33,33 4,76 2,38 2,38 0 0 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A B C Loại vacxin Tỉ lệ (%) 10^8 10^9 3x10^9 ĐC
Biểu đồ 4. 1. Tỉ lệ cá chết của thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu
Nhƣ vậy, bằng thực nghiệm ta có thể khẳng định chất bổ trợ nhũ dầu dùng trong thí nghiệm này không có độ an toàn, đem lại tác dụng không tốt cho cá mà theo hai tác giả Tyler và Klesius (1994), chất bổ trợ nhũ dầu tiêm vào xoang bụng của cá nheo Ictalurus punctatus làm giảm khả năng đề kháng với vi khuẩn Ed. ictaluri.
Kết luận đƣợc rút ra từ thí nghiệm 1 là:
Chất bổ trợ nhũ dầu Montanide 70M-PG của Seppic không hoạt động,
không an toàn.
Có thể độc lực của các chủng vi khuẩn có vấn đề: một là vi khuẩn đã
hoàn toàn mất độc lực, hai là trong quá trình bảo quản làm vi khuẩn yếu độc lực.