thỏ mang thai Thỏ con sinh ra do thụ tinh nhân tạo lúc 1 tháng tuổi Thỏ con sinh ra do thụ tinh nhân tạo lúc 1 tháng tuổi
Phụ lục
Quy trình kỹ thuật pha long bảo tồn tinh dịch thỏ B−ớc 1: Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất
a. Dụng cụ
Các dụng cụ cần thiết gồm: Dụng cụ pha môi tr−ờng, thu nhận tinh dịch, kiểm tra tinh dịch, cân phân tích…
- Dụng cụ pha môi tr−ờng: Các ống đong, bình tam giác có thể tích t−ơng ứng với l−ợng môi tr−ờng cần pha, đũa thuỷ tinh…
- Dụng cụ thu nhận tinh dịch: âm đạo giả, bao cao su, các lọ hứng tinh, các pipet pasteur nhựa, các lọ đựng dạng 10ml và 100ml, nhiệt kế có thang đo 1000C, xilanh, pipet thuỷ tinh 5ml.
- Các dụng cụ bằng thuỷ tinh đ−ợc rửa sạch, tráng lại bằng n−ớc cất sau đó bằng cồn và sấy khô trong tủ sấy. Các dụng cụ bằng nhựa đ−ợc rửa sạch, tráng bằng n−ớc cất và bằng cồn sau đó để khô tự nhiên.
b. Hoá chất
Gồm có: Tris, acide citric, Trisodium citrate, glucose, fructose, penicillin, streptomycin, n−ớc cất hai lần, glycerol, dimethyl sulfoxide, lòng đỏ trứng gà, vaseline, eosin 5%, dung dịch n−ớc muối 1% và 3%, cồn sát trùng 70%.
B−ớc 2: Cân hoá chất
- Môi tr−ờng Tris gồm các thành phần ( Tris 3,80g, axide citrie 2,165g; glucose 0,6g; penicillin 60mg, Streptomycin 60mg, n−ớc cất 100ml).
- Môi tr−ờng Cirtate gồm: (Trisodium citrate 1,323g, glucose 0,59466g, fructose 0,59466g, penicillin 60mg, Streptomycin 60mg, n−ớc cất 100ml).
Đun cách thuỷ 100ml n−ớc cất 2 lần đến nhiệt độ sôi, sau đó lần l−ợt hoà tan muối Tris, acide citric, Trisodium citrate, đ−ờng vào n−ớc cất, khi nhiệt độ hạ suống 370C cho penicillin, Streptomycin vào và khuấy nhẹ bằng khuấy từ cho tan trong 40 phút. Đổ môi tr−ờng vào lọ tam giác bảo tồn ở tủ bảo ôn có nhiệt độ 4 – 50C không quá 3 ngày.
Nếu môi tr−ờng có bổ sung lòng đỏ trứng gà, glycerol, dimethyl sulfoxide, thì đ−ợc chia ra làm 2 hoặc 3 phần để bổ sung lòng đỏ trứng gà, glycerol, dimethyl sulfoxide tuỳ theo nồng độ và tiếp tục khuấy từ trong thời gian 40 – 45 phút.
B−ớc 4: Thu nhận tinh dịch
- Cần thiết có tối thiểu 1 ng−ời tham gia lấy tinh và một ng−ời sẵn sàng kiểm tra mẫu. Tinh dịch đ−ợc thu nhận bằng âm đạo giả, có sử dụng thỏ cái làm giá nhảy. Tr−ớc khi thu nhận tinh dịch, chuẩn bị âm đạo giả, n−ớc nóng 42 – 450C, buộc bao cao su vào pipet nhựa lắp vào âm đạo giả bơm n−ớc nóng 42 – 450C và bơm không khí vào trong lòng âm đạo giả để tạo áp lực vừa phải.
- Cho thỏ đực nhẩy giá và thu nhận tinh dịch
B−ớc 5: Kiểm tra số và chất l−ợng tinh dịch
- Kiểm tra thể tích, hoạt lực tinh trùng tiến thẳng, nồng độ tinh trùng, độ pH, sức kháng.
- Tỉ lệ tinh trùng sống, tỉ lệ tinh trùng kỳ hình: nhỏ một giọt tinh dịch vào lam kính, nhỏ một giọt eosin 5% vào giọt tinh dịch, dùng đũa thuỷ tinh khấy nhẹ, dùng một lam kính thứ hai và dùng đũa thuỷ tinh chấm nhẹ giọt tinh dịch đ/ chộn với eosin chấm vào lam kính thứ hai để làm tiêu bản. Tỉ lệ tinh trùng sống đ−ợc đếm ngay lập tức trong vòng từ 1 – 2 phút sau khi nhuộm, sau 2 phút thì không nên đếm tiếp vì có thể sẽ không còn chính sác. Tiêu bản kỳ hình đ−ợc làm cùng với tiêu bản sống chế nh−ng đ−ợc để lại kiểm tra sau.
B−ớc 6: Pha lo/ng tinh dịch
- Môi tr−ờng pha lo/ng để trong chậu n−ớc ấm có nhiệt độ 350C. - Sau khi đ/ có tinh dịch, tinh dịch đựơc đựng trong lọ thuỷ tinh 10ml (tinh dịch đ/ loại bỏ keo phèn), môi tr−ờng pha lo/ng đựơc rót nhẹ nhàng vào thành trong lọ đựng tinh dịch, tuỳ theo bội số pha lo/ng (1 tinh dịch: 10 môi tr−ờng, 1 tinh dịch: 5 môi tr−ờng), bịt kín lọ và lắc nhẹ cho đều tinh dịch với môi tr−ờng.
B−ớc 7: Bảo tồn tinh dịch thỏ pha lo/ng
- Bịt kín lọ đựng tinh dịch đ/ pha lo/ng với môi tr−ờng, ghi phía bên ngoài lọ đựng tinh pha lo/ng: số tai thỏ đực, ngày lấy tinh, tên môi tr−ờng pha lo/ng, sau đó để vào trong cốc đựng n−ớc sạch có nhiệt độ 350C, sao cho phần tinh lỏng vừa ngập trong n−ớc.
- Chuyển vào tủ có điều chỉnh nhiệt độ bảo tồn ở 150C.
Quy trình kỹ thuật pha loãng bảo tồn tinh dịch thỏ với môi tr−ờng Tris Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất Môi tr−ờng Tris đ/ pha lo/ng Thu nhận tinh dịch
Kiểm tra tinh dịch
Pha lo/ng tinh dịch với môi tr−ờng