và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1 Đối t−ợng và địa điểm nghiên cứu
- Đối t−ợng nghiên cứu: Tinh dịch của 125 thỏ đực thuộc các giống: New Zealand, California, Panon, thỏ xám và thỏ đen nuôi tại trung tâm Nghiên cứu Dê - thỏ Sơn Tây. Đực giống có khối l−ợng 2,5 – 4,5kg, tuổi từ 8 tháng đến 40 tháng, khoẻ mạnh, giao phối thuần thục, đang trong thời kỳ cho tinh phục vụ công tác giống, chế độ nuôi d−ỡng theo khẩu phần thức ăn của Trung tâm Nghiên cứu Dê - Thỏ Sơn Tây, bao gồm thức ăn tinh hỗn hợp 16% protein 80g/ngày và 600gam thức ăn thô xanh đ−ợc sử dụng.
Thỏ cái dùng để thụ tinh nhân tạo thuộc các giống : New Zealand, California, Panon, thỏ xám và thỏ đen, thỏ khỏe mạnh, sinh sản bình th−ờng và đ/ đẻ từ 1 lứa trở lên.
- Địa điểm: Phòng Sinh học tế bào sinh sản - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trung tâm Nghiên cứu Dê - Thỏ Sơn Tây
3.2 Nội dung và Ph−ơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Nội dung nghiên cứu
* Nghiên cứu đặc điểm sinh học tinh dịch thỏ
L−ợng tinh dịch V (ml/lần), hoạt lực tinh trùng tiến thẳng A (%), nồng độ tinh trùng C (triệu/ml), tỷ lệ tinh trùng sống LS (%), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình K (%), tổng số tinh trùng tiến thẳng V.A.C (triệu/lần).
Khảo sát một số đặc điểm lý – hóa học của tinh dịch thỏ: áp lực thẩm thấu, tỷ trọng, độ nhớt, năng lực đệm, pH.
Sự thay đổi các chỉ tiêu sinh học tinh dịch thỏ qua các tháng trong năm
ảnh h−ởng của khoảng cách thời gian giữa hai lần lấy tinh đến các chỉ tiêu sinh học
* Nghiên cứu pha lo/ng, bảo tồn tinh dịch thỏ
ảnh h−ởng của chất bảo vệ lạnh lên phẩm chất tinh dịch thỏ
ảnh h−ởng của nhiệt độ bảo quản lên phẩm chất tinh dịch thỏ
ảnh h−ởng của bội số pha lo/ng lên phẩm chất tinh dịch thỏ
ảnh h−ởng của đ−ờng glucose, fructose lên phẩm chất tinh dịch thỏ * Thử nghiệm thụ tinh nhân tạo cho thỏ
3.2.2 Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.2.2.1 L−ợng tinh dịch V (m/lần)
Xác định theo ph−ơng pháp của Milovanov (1962), qua ống hút pipet thuỷ tinh có chia độ hoặc theo độ đ/ chia sẵn trong phễu hứng tinh, đặt lọ tinh dịch trên mặt phẳng nằm ngang và đọc kết qủa ở vạch cong d−ới của mặt tinh dịch.
3.2.2.2 Hoạt lực tinh trùng A ( %)
Theo ph−ơng pháp của Milovanov (1962): sức hoạt động của tinh trùng đ−ợc tính bằng tỷ lệ phần trăm tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi tr−ờng quan sát. Đánh giá theo thang 1.0 điểm nh− sau: Điểm 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 % Tinh trùng tiến thẳng 100 - 95 95 - 85 85 - 75 75 - 65 65 - 55 55 - 45 45 - 35 35 - 25 25 - 15 15 - 5 Các b−ớc tiến hành:
Dùng đũa thuỷ tinh sạch lấy một giọt tinh dịch đặt lên phiến kính sạch, và có nhiệt độ 30 - 350C. Dùng lá men khô, sạch đậy lên giọt tinh dịch sao cho giọt tinh dịch đ−ợc dàn đều ra 4 cạnh của lá kính. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi (Olympus) và xem với độ phóng đại 200 - 400 lần. Khi kiểm tra hoạt lực tinh trùng, tiêu bản đ−ợc s−ởi ấm ở 370C.
Tinh trùng có 3 hình thức vận động: tiến thẳng - xoay vòng - lắc l−.
3.2.2.3 Nồng độ tinh trùng C (triệu/ml)
Theo ph−ơng pháp của Milovanov (1962), dùng buồng đếm hồng - bạch cầu (kiểu Neubouer) và ống pha lo/ng hồng cầu, pha lo/ng tinh dịch 200 lần bằng dung dịch NaCl 3% (hút tinh dịch đến vạch 0,5 rồi hút NaCl 3% đến vạch 101). Trộn đều tinh dịch đ−ợc pha lo/ng, bỏ 3 - 4 giọt đầu, nhỏ 1 giọt vào buồng đếm đ/ chuẩn bị. Đếm tinh trùng trong các ô đếm hồng cầu (4 ô trung bình ở 4 góc và 1 ô ở giữa, mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích 1/400 mm2 và độ sâu 1/10 mm).
Nguyên tắc đếm
Đếm tinh trùng theo đầu, theo hàng, hết hàng nọ đến hàng kia theo hình chữ chi. Những tinh trùng nằm trên cạnh ô nhỏ chỉ đếm hai cạnh (th−ờng là cạnh trên và cạnh phải). Đếm cả hai buồng đếm rồi lấy kết qủa trung bình, nếu kết qủa hai bên chênh nhau 30% thì phải làm lại. Nếu tinh trùng tụ thành đám thì phải làm lại. Công thức tính: . .4000x1000 N D n C =
Trong đó: C: nồng độ tinh trùng trong tinh dịch n: số tinh trùng đếm đ−ợc
D: mức độ pha lo/ng N: số ô con đ/ đếm
3.2.2.4 Tổng số tinh trùng tiến thẳng V.A.C ( Triệu/lần)
Xác định theo ph−ơng pháp của John B. Herrick và Self (1962): tổng số tinh trùng tiến thẳng = l−ợng tinh dịch (ml) ì hoạt lực tinh trùng tiến thẳng ì nồng độ tinh trùng/ml.
3.2.2.5 Tỷ lệ tinh trùng sống LS ( %)
Theo ph−ơng pháp của Chemineau và cộng sự (1991).
Dung dịch nhuộm: Eosin: 1g; Nigrosin: 2g; Tri-Na-citrate, 5.5H2O: 3,57g; n−ớc cất 2 lần 100ml. (pH dung dịch nhuộm: 6,7 - 6,8; áp suất thẩm thấu 310 miliosmol).
Tiến hành
Dùng phiến kính sạch và để ấm ở nhiệt độ +300C.
Nhỏ 3 giọt dung dịch nhuộm (t−ơng đ−ơng với 30 microlit) lên một đầu của phiến kính.
Thêm một giọt tinh dịch và trộn đều với dung dịch nhuộm trong vòng 10 giây.
Viết số liệu con đực và ngày lấy tinh lên tiêu bản Sau khi pha trộn để 50 giây.
Dùng phiến kính thứ 2 nhẹ nhàng san đều hỗn hợp đ/ nhuộm.
Đếm tổng số không d−ới 150 tinh trùng, đều ở các vùng, tinh trùng sống không bắt mầu.
- Tính tỷ lệ %:
LS (%) = x 100
3.2.2.6 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình K (%)
Xác định theo ph−ơng pháp của Villiam (1921) kết hợp với ph−ơng pháp của Chemineau (1991).
Làm tiêu bản
Phết kính: phết một lớp mỏng, đều tinh dịch lên phiến kính, hong
Số tinh trùng sống Tổng số tinh trùng đếm
khô tiêu bản trong không khí. Nhuộm màu tinh trùng, nhuộm đơn trong vòng 5 - 10 phút với các loại thuốc nhuộm (xanh methylen, đỏ fucsin, hỗn hợp eosin và nigrosin...). Rửa tiêu bản bằng sức loang của giọt n−ớc cất. Quan sát trên kính hiển vi Olympus với độ phóng đại 200; 400; 1000 lần.
Đếm: lấy mẫu ngẫu nhiên, đếm lần l−ợt 300 - 500 tinh trùng bất kỳ, cả tinh trùng bình th−ờng và tinh trùng kỳ hình. Tính: %= ì100 N n K Trong đó: K(%):Tỷ lệ % tinh trùng kỳ hình n: Số tinh trùng kỳ hình các loại N: Tổng số tinh trùng đếm (N = 300 - 500) 3.2.2.7 Sức kháng của tinh trùng R (lần)
Theo ph−ơng pháp dây chuyền của Milovanov (1962) kết hợp với công thức do Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh cải tiến (1993) [13].
Dùng 3 lọ sạch, dung tích mỗi lọ 10ml, đánh số thứ tự I, II, III. Rót dung dịch NaCl 1% vào lọ I: 5ml; lọ II: 1ml; lọ III: 0,5ml.
Dùng ống hút vi l−ợng hút 0,01ml tinh dịch nhỏ vào lọ I, lắc nhẹ, trộn đều, tinh dịch pha lo/ng 500 lần (5:0,01).
Hút 01ml từ hỗn hợp trong lọ I nhỏ vào lọ II, lắc nhẹ, trộn đều (tinh dịch đ−ợc pha lo/ng 1000 lần).
Dùng ống hút khác hút 0,5ml hỗn hợp trong lọ II nhỏ vào lọ III, tinh dịch pha lo/ng 2000 lần (1000 ì 2).
Dùng đũa thuỷ tinh lấy 1 giọt hỗn hợp trong lọ III, đặt lên phiến kính để kiểm tra sức hoạt động tinh trùng. Nếu thấy có tinh trùng tiến thẳng, thì thêm 0,1ml dung dịch NaCl 1% vào lọ III. Mức pha lo/ng sẽ là 2200 lần (1,1 ì 2000). Sau đó lại kiểm tra hoạt lực tinh trùng. Nếu có tinh trùng tiến thẳng lại thêm 0,1ml dung dịch NaCl 1%. Công việc đ−ợc tiến
hành đến khi tinh trùng ngừng tiến thẳng.
Sức kháng đ−ợc tính theo công thức của Milovanov (1933)
v V
R= (1)
Trong đó: R: Sức kháng của tinh trùng.
V: l−ợng dung dịch NaCl 1% đ/ sử dụng. v: l−ợng tinh dịch đ/ dùng để kiểm tra
* Công thức do Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh cải tiến.
R = ro + r.n (2)
Trong đó: R: sức kháng của tinh trùng.
r0: mức pha lo/ng tinh trùng ở thời điểm lúc đầu (r0 = 2000 lần).
r: mức pha lo/ng của mỗi lần thêm dung dịch NaCl 1% về sau (r =200).
n: số lần thêm dung dịch NaCl 1% về sau.
3.2.3 Ph−ơng pháp xác định tính chất lý- hóa học của tinh dịch và môi tr−ờng bảo tồn
3.2.3.1 Xác định pH
Đo bằng máy pH meter (pH: 0 - 14 - h/ng METTLER DELTA 320) và giấy đo pH của Trung Quốc, nhúng ngập giấy vào tinh dịch và đọc kết quả sau 5 giây.
3.2.3.2 áp lực thẩm thấu (posm)
Đo bằng máy đo áp lực thẩm thấu (osmometre), đơn vị: Miliosmol/kg (đo tại Khoa Thận Nhân tạo - Bệnh viện Bạch Mai).
3.2.3.3 Tỷ trọng (d) Dùng bình đo tỷ trọng (picrometre) Công thức tính: 0 M M d = Trong đó: d : tỷ trọng M0 : khối l−ợng n−ớc cất 2 lần M : khối l−ợng chất lỏng cần đo cùng thể tích. 3.2.3.4 Độ nhớt (ηηηη)
Sử dụng nhớt kế Oswald hoặc micropipet. Xác định độ nhớt ở 20oC. Công thức tính: 0 0 . t d t d = η
Trong đó: η : độ nhớt t−ơng đối so với n−ớc cất 2 lần do : tỷ trọng n−ớc cất 2 lần.
to : thời gian chảy của n−ớc cất qua phần phình hoặc qua mao quản. d : tỷ trọng chất lỏng cần đo
t : thời gian chảy của chất lỏng qua phần phình hoặc qua mao quản.
3.2.3.5 Năng lực đệm (ββββ)
Theo ph−ơng pháp của Salisbury, đối với HCl 0,1N. Dùng một lọ con khô sạch, trung tính, có dung tích 5 - 10ml; cho vào đó 1ml (hoặc 0,5 ml) chất lỏng cần kiểm tra, đo pH chất lỏng. Dùng ống hút vi l−ợng nhỏ dung dịch HCl 0,1N (n = 3,6) vào lọ trên cho đến khi đạt pH = 4,0. Ghi lại độ chênh lệch pH (dpH). Công thức tính: 100 . 1000 . . ì = β v dpH n a Trong đó: β: Năng lực đệm tính trong 1000ml chất lỏng.
a: L−ợng axit đ/ dùng (l−ợng HCl 0,1N). n: Đ−ơng l−ợng gam của axit.
dpH: Chênh lệch pH tr−ớc và sau khi xử lý. v: L−ợng chất lỏng đ/ dùng.
3.2.4 Pha loãng và bảo tồn tinh dịch thỏ
* Môi tr−ờng pha long tinh dịch thỏ.
Môi tr−ờng Tris: (Tris 3,80g; acid Citric 2,1659g; glucose 0,6g; penicillin 60mg, streptomycin 60mg; n−ớc cất 100ml)
Môi tr−ờng Citrate: (Trisodium citrate 1,323g; glucose 0,59466g; fructose 0,59466g; penicillin 60mg, streptomycin 60mg; n−ớc cất 100ml). * Ph−ơng pháp lấy tinh dịch, pha long và bảo tồn tinh dịch thỏ .
- Kỹ thuật pha môi tr−ờng
Đun cách thủy 100ml n−ớc cất 2 lần đến nhiệt độ sôi. Sau đó lần l−ợt hòa tan muối Tris, acid citric, trisodium citrate, đ−ờng vào n−ớc cất. Khi nhiệt độ hạ xuống 370C pha penicillin, streptomycin, bổ sung lòng đỏ trứng gà. Khuấy nhẹ trong 40 phút. Bảo quản môi tr−ờng ở 4 - 50C không qúa 3 ngày.
- Ph−ơng pháp lấy tinh thỏ: Tinh dịch thỏ đ−ợc lấy bằng âm đạo giả của Hungari, tinh dịch đ−ợc thu vào ống có chia độ. Nhiệt độ âm đạo giả 42 – 450C (theo ph−ơng pháp của Morrel, 1995). Lấy tinh 2 – 4 lần trong tuần, lấy tinh vào buổi sáng. Dụng cụ lấy tinh đ−ợc vô trùng tr−ớc khi sử dụng. - Kỹ thuật pha lo/ng tinh dịch với môi tr−ờng:
+ Môi tr−ờng pha lo/ng để ở nhiệt độ 350C.
+ Tinh dịch thỏ đựng trong ống hứng tinh (tinh dịch đ/ đ−ợc loại bỏ keo phèn), đặt vào cốc n−ớc ấm 350C, kiểm tra phẩm chất tinh dịch. Môi tr−ờng pha lo/ng đ−ợc rót nhẹ nhàng vào ống đựng tinh dịch, với bội số pha lo/ng 1:5 (1 phần tinh dịch : 5 phần môi tr−ờng) hoặc 1:10.
+ Bịt kín lọ và lắc nhẹ.
- Kỹ thuật bảo tồn tinh dịch thỏ ở 150C
+ Bịt kín lọ đựng tinh dịch thỏ đ/ pha lo/ng với môi tr−ờng, ghi phía bên ngoài cốc đựng tinh pha lo/ng: Số tai thỏ đực, ngày lấy tinh, tên môi tr−ờng pha lo/ng. Sau đó đặt vào trong cốc đựng n−ớc sạch có nhiệt độ 350C, sao cho phần tinh lỏng vừa ngập trong n−ớc.
+ Chuyển vào tủ có điều chỉnh nhiệt độ, bảo tồn ở nhiệt độ 150C. * Ph−ơng pháp pha lo/ng các chất bảo vệ lạnh, glucose, fructose, nhiệt độ bảo tồn, bội số pha lo/ng
Các chất bảo vệ lạnh (glycerol, DMSO, lòng đỏ trứng gà), glucose và fructose đều đ−ợc chúng tôi pha với môi tr−ờng Tris.
- Môi tr−ờng có bổ sung 1% glycerol và 6% DMSO: Từ môi tr−ờng Tris chúng tôi chia làm 3 phần bằng nhau (môi tr−ờng A, B, C), môi tr−ờng A là môi tr−ờng Tris, môi tr−ờng B chúng tôi bổ sung 1% glycerol, môi tr−ờng C chúng tôi bổ sung 6 % DMSO.
- Môi tr−ờng Tris có bổ sung 1% glycerol, 5% glycerol: Từ môi tr−ờng Tris chúng tôi chia làm 2 phần bằng nhau (môi tr−ờng A, B), môi tr−ờng A chúng tôi bổ sung 1% glycerol, môi tr−ờng B chúng tôi bổ sung 5% glycerol.
- Môi tr−ờng Tris có bổ sung 14% và 20% lòng đỏ trứng gà: Từ môi tr−ờng Tris chúng tôi chia làm 2 phần bằng nhau (môi tr−ờng A, B), môi tr−ờng A chúng tôi bổ sung 14% lòng đỏ trứng gà, môi tr−ờng B chúng tôi bổ sung 20% lòng đỏ trứng gà.
- Môi tr−ờng Tris có glucose, fructose: Môi tr−ờng A với thành phần cơ bản là Tris chúng tôi bổ sung 0,6g glucose, môi tr−ờng B với thành phần cơ bản là Tris chúng tôi bổ sung 0,6g fructose.
Tất cả các môi tr−ờng trên đều đ−ợc chúng tôi dùng khuấy từ để khuấy trong 45 phút, sau đó đổ vào bình tam giác và ghi bên ngoài tên
môi tr−ờng, ngày pha lo/ng, để vào tủ bảo ôn có nhiệt độ 4 - 50C và không để quá 3 ngày.
- Đối với nhiệt độ bảo tồn: từ môi tr−ờng Tris sau khi đ−ợc pha lo/ng chúng tôi chia làm hai phần bằng nhau (môi tr−ờng A, B) để pha lo/ng với tinh dịch, môi tr−ờng A đ−ợc bảo tồn ở 50C, môi tr−ờng B bảo tồn ở 150C, bên ngoài cốc đựng môi tr−ờng ghi rõ ngày lấy tinh, nhiệt độ bảo tồn, số tai thỏ đức giống, l−ợng tinh dịch…
- Đối với bội số pha lo/ng (tinh dịch : môi tr−ờng): khi thu đ−ợc l−ợng tinh dịch, những mẫu tinh đủ tiêu chuẩn pha lo/ng đ−ợc chia làm 2 phần bằng nhau, đổ vào 2 lọ riêng biệt (lọ A và lọ B), lọ A đựng tinh dịch đ−ợc pha lo/ng với bội số (1 tinh dịch : 5 môi tr−ờng), lọ B đựng tinh dịch đ−ợc pha lo/ng với bội số (1 tinh dịch : 10 môi tr−ờng). Các lọ đều đ−ợc ghi ngày lấy tinh, bội số pha lo/ng, l−ợng tinh dịch, số tai thỏ đực giống… Tất cả các mẫu tinh nguyên đều đ−ợc kiểm tra thể tích tinh dịch, hoạt lực tinh trùng tiến thẳng, chỉ những mẫu tinh nào có hoạt lực tinh trùng tiến thẳng từ 60% trở lên mới đ−ợc chúng tôi đ−a vào pha lo/ng, các mẫu tinh có hoạt lực tinh trùng tiến thẳng thấp hơn 60% chúng tôI đều loại bỏ không đ−a và sử dụng. Các mầu tinh đ−ợc đ−a vào pha lo/ng, chúng tôi chia đều l−ợng tinh dịch vào các lọ đựng tinh (tuỳ theo thiết kế thí nghiệm là 2 hoặc 3 phần bằng nhau) để pha với môi tr−ờng và bảo tồn. - Tinh dịch pha với môi tr−ờng ở các thiết kế thí nghiệm đ−ợc bảo tồn từ 0 giờ đến 72 giờ, trong quá trình bảo tồn các mẫu tinh pha lo/ng đề đ−ợc kiểm tra về hoạt lực tinh trùng tiến thẳng, tỉ lệ tinh trùng sống, tỉ lệ tinh trùng kỳ hình, theo ph−ơng pháp của Milovanov (1962), Villiam (1921) và Chemineau và cộng sự (1991).
(Qui trình kỹ thuật pha lo/ng bảo tồn tinh dịch thỏ xem phần phụ lục).
3.2.5 Thụ tinh nhân tạo
bơm tinh dịch vào trong tử cung với liều phối 2ml, có số tinh trùng tiến thẳng từ 80 – 100 triệu/lần phối, phối lặp (2 lần). Thỏ cái giống đ−ợc phối bằng TTNT là giống New Zealand thuần, thỏ đen, sau khi phối đ−ợc 10 ngày thì kiểm tra thỏ chửa, khi thỏ đẻ đ−ợc theo dõi đến lúc 1 tháng tuổi.
Ph−ơng pháp xử lý số liệu: số liệu đ−ợc xử lý theo ch−ơng trình phần mềm Excel 5.0 và Minitab (ANOVA – One – Way).
Trình bày kết quả: X ±Sx ( ) ∑ − = + + + = n i i n x n x x x n X 1 2 1 1 ... 1 ( ) n n x x S n i x 1 1 2 − − = ∑ − trong đó X : số trung bình cộng x
S : sai số của số trung bình x: biến số