* Triệu chứng héo vàng (khô thân)
Trên ựồng ruộngcây bị bệnh thường có màu xanh hoặc hơi vàng. Trên thân cây vết bệnh ựầu tiên thường xuất hiện ở phần thân gần gốc. Lúc ựầu vết bệnh không có hình dạng nhất ựịnh chạy dài theo dọc thân cây và có màu ựỏ
tắa, sau ựó vết bệnh lan rộng vùng thân cây bị bệnh thường bị khô chết (khô thân). Cây non bị bệnh thường bị gãy hay ựổ gục xuống khi có gió, cây trưởng thành lá chuyển vàng và héo, thân khô, quả bị chắn ép, hạt lép, năng suất và sản lượng vừng giảm. Hình 3.2. Triệu chứng bệnh héo rũ xanh cây Hình 3.3.Triệu chứng bệnh héo vàng 3.1. 2. Mức ựộ gây hại của bệnh héo vừng tại một số vùng ở Nghệ An
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 43
Trong năm 2008 Ờ 2009 mức ựộ gây hại của bệnh héo rũ xanh cây và héo vàng trên vừng trong vụ hè thu tại một số xã thuộc các huyện Nghi Lộc, Diễn Châu và Thị xã Cửa Lò ựã ựược ựiều tra ở các giai ựoạn: cây con, ra hoa Ờ hình thành quả và trước khi thu hoạch. Kết quả cho thấy mức
ựộ gây hại của bệnh héo vừng tại các vùng rất khác nhau. Mức ựộ gây hại phụ thuộc vào ựiều kiện tiểu khắ hậu của từng vùng, từng chân ựất, từng thời vụ khác nhau. Trong quá trình ựiều tra có thể bắt gặp cây vừng chết hàng loạt, có khi cả ruộng thậm chắ cả cánh ựồng.
Hình 3.4. Ruộng vừng bị héo tại Diễn Châu - Nghệ An Vụ Hè Thu Ờ 2009 Vụ Hè Thu Ờ 2009
Bảng 3.1. Mức ựộ gây hại của bệnh héo vừng tại Nghệ An Vụ hè thu 2009
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 44
địa ựiểm Tỉ lệ cây chết ( %) TT
Huyện Xã Tổng số Héo rũ
xanh cây Héo vàng
1 Nghi Lộc Nghi Trung 32,8 20,5 12,3
2 -- Nghi Hoa 33,7 24,1 9,6 3 -- Nghi Khánh 45,6 31,8 13,8 4 -- Nghi Liên 30,3 19,8 10,5 5 -- Nghi Phương 25,5 18,3 7,2 6 -- Nghi Xá 24,9 15,7 9,2 7 -- Nghi Ân 31,4 21,8 9,6 8 -- Nghi Thạch 39,4 23,5 15,9 9 -- Nghi Ân 35,6 26,3 9,3 10 TX Cửa Lò Nghi Hương 32,5 22,5 10,0 11 - Nghi Thu 36,4 28,7 7,7 12 Diễn Châu Diễn Hùng 21,4 15,2 6,2 13 - DiễnVạn 24,6 18,3 6,3 14 - Diễn Kim 24,7 14,2 10,5 15 - Diễn Mỹ 25,6 16,5 9,1 16 - Diễn Thịnh 21,3 14,2 7,1 17 - Diễn Lộc 25,7 15,2 10,5 18 - Diễn Thọ 27,5 18,4 9,1 19 - Diễn Thắng 22,1 16,2 5,9 20 - Diễn Trung 10,8 6,4 4,4
Bảng 3.1. cho thấy tại Nghi Lộc bệnh héo vừng hại nặng nhất: tỉ lệ
vừng bị bệnh héo tại dao ựộng từ 24,9- 45,6%, cao nhất tại các xã Nghi Khánh (45,6%), Nghi Thạch (39,4%) và Nghi Ân (35,6%).
Kết quảựiều tra bệnh tại 2 xã Nghi Hương và Nghi Thu, Thị xã Cửa Lò cũng cho thấy mặc dù nằm gần biển có tiểu vùng khắ hậu mát hơn và ựộ ẩm
ựát cao hơn so các xã của huyện Nghi Lộc song tỉ lệ bệnh héo vừng vẫn rất cao, ở Nghi Thu 36,4% và Nghi Hương 32,5%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 45
Huyện Diễn Châu là vùng trồng vừng trọng ựiểm của Nghệ An, ựất có tỷ lệ pha cát thấp, ựiều kiện khắ hậu thuận lợi hơn so với các vùng khác, trình
ựộ canh tác của nông dân khá cao do ựó tỷ lệ bệnh héo vừng thấp hơn so với các vùng khác và dao ựộng từ 10,8- 25,6%.
Như vậy, tại Nghệ An bệnh hiện tượng bệnh héo vừng xuất hiện và gây hại nặng ở hầu hết tất cả các vùng trồng vừng chắnh trên ựịa bàn tỉnh, tỉ lệ cây bệnh biến ựộng cao và dao ựộng từ 10,8- 45,6% phụ thuốc vào nhiều yếu tố quan trọng như kỹ thuật canh tác, thời vụ, giống, chân ựất,... Trong số 2 loại bệnh gây triệu chứng héo cây vừng thì bệnh héo rũ xanh cây gây nặng nhất, từ 6,4 ựến 31,8%., bệnh héo vàng gây hại với tỷ lệ bệnh từ 4,4-13,8%.
3.2 Kết quả xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh héo cây vừng tại Nghệ An 3.2.1 Thu thập mẫu bệnh héo vừng
Thu mẫu bệnh cây là ựiều cần thiết khi nghiên cứu tác nhân gây bệnh. Các mẫu bệnh cây vừng bị héo ựược thu thập ở tất cả các ựiểm ựiều tra ựể
phân lập, giám ựịnh nguyên nhân gây bệnh bệnh héo vừng, làm cơ sở cho các thắ nghiệm tiếp theo, 70 mẫu cây vừng bị héo ựã ựược thu thập ựại diện cho các vùng trồng vừng của Nghệ An (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả thu thập mẫu bệnh tại các ựịa phương Triệu chứng
TT địa ựiểm
Héo rũ xanh cây Héo vàng
Số mẫu
1 Diễn Châu 24 15 39
2 Nghi Lộc 15 8 23 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 TX Cửa Lò 4 4 8
Tổng 43 27 70
3.2.2. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật gây bệnh
để xác ựịnh chắnh xác tác nhân gây bệnh héo xanh và héo vàng, chúng tôi tiến hành phân lập mẫu bệnh ở những cây vừng mới biểu hiện triệu chứng héo, vì
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 46
những mẫu thu ngoài ựồng bị nhiễm lâu ngày thường khó hoặc không thể phân lập ựược tác nhân chắnh, hoặc mẫu ựã bị tạp nhiễm do vi sinh vật hoại sinh khác. Mẫu bệnh thu ngày nào thì ựược xử lý ngay sau ựó ựểựạt hiệu quả cao.
Từ những mẫu cây bị bệnh thu ựược ở các vùng trồng vừng chắnh ở
Nghệ An, chúng tôi ựã tiến hành xác ựịnh các triệu chứng ựiển hình, nuôi vi sinh vật gây bệnh.
3.2.3 Kết quả nghiên cứu, giám ựịnh bệnh theo phương pháp thường quy * Triệu chứng bệnh héo vàng
Từ kết quả phân lập, nuôi cấy ựã xác ựịnh ựược một số dòng nấm bệnh gây hiện tượng héo vàng (khô thân) trên môi trường nhân tạo (hình 3.8).
Trên môi trường PDA, tản nấm thường có màu trắng xám nhạt ựến xám
ựậm. Khối bào tử có màu hồng gạch. Trên môi trường PDA bào tử hình thành trong ựĩa cành (hình 3.5). đĩa cành kắch thước 60,5 x 109,9ộm. Trên ựĩa cành có lông gai cứng, màu nâu ựậm, hình trụ mọc thẳng, có 1-2 vách ngăn, phần gốc phồng nhẹ và thuôn dần về phắa ựỉnh, kắch thước 30-65x4ộm.
Hình 3.5 Tản nấm ựĩa cành và Colletotrichum sp. trên môi trường PDA
Cành bào tử phân sinh hình trụ ngắn. Bào tử phân sinh hình trụ, hai ựầu tròn, có màu hồng gạch, kắch thước chiều dài 10,98 ổ1,12 ộm, kắch thước chiều rộng 3,43 ổ 0,18ộm. Bào tử hình thành 3 ngày sau cấy. Khi nuôi cấy trong ựiều kiện thắ nghiệm nhiệt ựộ 25-300C bào tử nấm bắt ựầu nảy mầm sau 6h, sau 12-24
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 47
giờ ống mầm phát triển dài ra hình thành giác bám và vòi hút, giác bám có hình ô van hay hình quảựấm có màu nâu.
đĩa cành hình thành trên bộ phận bị bệnh của cây thường có lông gai cứng, dài trên các bộ phận bị hại thường có từ 1-4 vách ngăn, mầu nâu, gốc phồng nhẹ và hơi nhọn ởựỉnh.
Dựa vào kết quả phân lập và quan sát triệu chứng trên ựồng ruộng kết hợp so sánh ựối chiếu với khoá phân loại và tài liệu phân loại nấm có liên quan (theo phương pháp Sutton, 1992) chúng tôi bước ựầu xác ựịnh ựược nấm gây triệu chứng héo vàng trên vừng là Colletotrichum sp.
* Triệu chứng bệnh héo rũ xanh cây (héo xanh)
Hình thái khuẩn lạc: Vi khuẩn gây triệu chứng héo xanh ựiển hình có khuẩn lạc thuộc dạng chảy lỏng hoặc khoanh tròn không chuẩn mực, nên nhiều khi khó xác ựịnh ựược hình dạng và kắch thước khuẩn lạc chuẩn. Hầu hết khuẩn lạc phát triển sau 72h trên môi trường TZCA, có màu ựỏ ựậm hơn so với thời ựiểm 48 giờ. Màu sắc khuẩn lạc rất ựa dạng từ màu trắng sữa, trắng trong, trắng hống ựến màu hồng, ựỏ tươi, ựỏ thẫm. Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, có màu phớt hồng ở tâm tạo thành một tập hợp màu phong phú. Dựa trên kết quả so sánh với khóa phân loại về vi khuẩn hại cây trồng [58], cũng như triệu chứng lâm sàng và thử về khả năng tiết dịch vi khuẩn khi cắt và nhúng cây bị bệnh vào cốc nước, tác nhân gây bệnh héo rũ xanh cây vừng thuộc loài Ralstonia solanacearum Smith. Trên cơ sở như vậy, ựể cho thuận tiện cho việc hướng dẫn kỹ thuật chúng tôi ựề nghị sử dụng tên cho tác nhân gây bệnh héo rũ xanh cây trên vừng với tên thông thường là bệnh Ộhéo xanh vi khuẩn hại vừngỢ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 48
Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường TZCA và PPGA
để kiểm chứng kết quả giám ựịnh vi khuẩn bằng hình thái học ở trên và trả lời câu hỏi liệu những chủng vi khuẩn này có thuộc hoặc có quan hệ gần gũi với loài R.solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây lạc, cà chua... hay không, các chủng vi khuẩn ựã ựược thử phản ứng siêu nhạy trên thuốc lá ựể xác ựịnh
ựộc tố và lây bệnh nhân tạo trên giống vừng V6 mẫn cảm với bệnh héo xanh.
* Kết quả thử phản ứng siêu nhạy và lây bệnh nhân tạo
độc tố của các dòng vi khuẩn phân lập ựược từ các mẫu vừng bị bệnh héo xanh ựược ựánh giá thông qua phản ứng siêu nhạy của lá cây thuốc lá. Dịch khuẩn của 10 nguồn vi khuẩn ựược phân lập từ các mẫu bệnh và ựược tiêm vào mô lá thuốc lá. Sau 36 giờ triệu chứng hoại tử của mô lá thuốc lá bắt ựầu xuất hiện và triệu chứng hoại tử trở nên rõ ràng hơn sau 48 giờ. Kết quả thắ nghiệm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 49
Hình 3.7. Kết quả thửựộc tắnh của vi khuẩn trên lá thuốc láBảng 3.3. Kết quả thửựộc tắnh của các nguồn vi khuẩn Bảng 3.3. Kết quả thửựộc tắnh của các nguồn vi khuẩn
Thời gian gây hoại tử mô thuốc lá (giờ) TT Nguồn vi khuẩn 36 48 1 Nghi Ân ổ + 2 Nghi Trường ổ + 3 Diễn Thịnh ổ + 4 Diễn Trung - ổ 5 Diễn Thịnh - ổ 6 Diễn Lộc - ổ 7 Diễn Thọ - ổ 8 Diễn Thắng - ổ 9 Nghi Hương ổ + 10 Nghi Thu ổ + đC Nước cất - - Ghi chú: ổ có biểu hiện vết hoại mô nhưng chưa rõ ràng - Không gây hoại tử mô thuốc lá
+ Gây hoại tử mô thuốc lá (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả bảng 3.3 cho thấy, 5 nguồn vi khuẩn thu thập từ Nghi Ân, Nghi Trường, Diễn Thịnh, Nghi Hương và Nghi Thu sau 36h tiêm cho thuốc lá ựã có triệu chứng gây hoại tử mô và sau 48h gây hoại tử mô thuốc lá một cách rõ ràng,
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 50
5/10 nguồn vi khuẩn còn lại sau 48h có triệu chứng gây hoai tử mô thuốc lá song vết hoại tử là không rõ và nhỏ.
Như vậy, 5 nguồn vi khuẩn phân lập từ các ựịa phương Nghi Ân, Nghi Trường, Diễn Thịnh, Nghi Hương và Nghi Thu có ựộc tắnh cao hơn cả.
Từ kết quả 5 nguồn vi khuẩn ựược ựánh giá là có ựộc tắnh cao, chúng tôi tiến hành lây bệnh nhân tạo cho giống vừng V6.
Bảng 3.4. Kết quả lây bệnh nhân tạo cho vừng Viện Bảo vệ thực vật, hè thu 2009 TT Tên nguồn vi khuẩn CSPB/SCTN TLB (%) TKTD (ngày) 1 Nghi Trường 28/30 93,33 7 2 Nghi Hương 22/30 73,33 9 3 Nghi Thu 23/30 70,60 9 4 Nghi Ân 17/30 56,67 9 5 Diễn Thịnh 29/30 96,67 7 6 đối chứng 0/30 0 12
Ghi chú: SCPB: Số cây phát bệnh SCTN: Số cây thắ nghiệm TLB: Tỉ lệ bệnh TKTD: Thời kỳ tiềm dục
Kết quả lây bệnh nhân tạo (bảng 3.4.) cho thấy: cả 5 nguồn vi khuẩn dùng ựể
lây bệnh thì cả 5 nguồn ựều thể hiện triệu chứng héo rũ xanh cây giống ngoài ựồng ruộng, trong ựó có 2 nguồn Nghi Trường và Diễn Thịnh gây triệu héo rũ xanh cây với tỉ lệ bệnh tương ứng là 93,33% - 96,67% cây thắ nghiệm. điều này chứng tỏ
nguồn vi khuẩn phân lập từ Nghi Trường và Diễn Thịnh có ựộc tắnh cao hơn cả. Kết qủa này phù hợp với kết quả thử ựộc tắnh vi khuẩn trên thuôc lá 3 nguồn vi khuẩn còn lại cũng gây hiện tượng héo rũ với tỉ lệ bệnh từ 56,67- 73,33%. Công thức ựối chứng không có cây nào biểu hiện triệu chứng bệnh.
Từ các cây vừng bị bệnh héo xanh trong thắ nghiệm ựã phân lập ựược vi khuẩn. Khuẩn lạc của các nguồn vi khuẩn này phát triển trên môi trương TZC
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 51
cũng tương tự như khuẩn lạc của các nguồn vi khuẩn phân lập từ các mẫu cây bị
bệnh héo xanh trong tự nhiên.
Kết quả của các nghiên cứu này ựã cho phép kết luận bệnh héo xanh vi khuẩn trên vừng ở Nghệ An là do vi khuẩn Rastonia solaracearum Smith gây ra.
3.2.4. Xác ựịnh tên vi khuẩn gây bệnh héo xanh vừng bằng công nghệ sinh học
để có cơ sở khoa học và kết luận chắnh xác về tên khoa học của vi sinh vật gây bệnh héo xanh cây vừng, chúng tôi ựã kết hợp với Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong việc giám ựịnh và kiểm chứng kết quả nghiên cứu ở trên.
Kỹ thuật PCR- RAPD ựã ựược sử dụng ựể xác ựịnh tên vi khuẩn cũng như
xác ựịnh mối quan hệ của dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên vừng với các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh cho lạc, cà chua thu thập ở các vùng khác nhau. Các
ựoạn mồi ựược sử dụng ựể phân tắch ADN của 2 nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh vừng thu thập từ Diễn Châu và Nghi Lộc Nghệ An và 9 chủng vi khuẩn R. solancearum phân lập từ trên lạc và cà chua ( bảng 3.5).
Bảng 3.5. Các chủng vi khuẩn phân lập trên các ký chủ và ựịa ựiểm khác nhau
Kắ hiệu phân tắch ADN Kắ hiệu phân lập mẫu Cây trồng ký chủ địa ựiểm lấy mẫu
P1 2 Lạc đông Phương Yên Ờ Hà Nội
P2 11 Lạc Việt Yên Ờ Bắc Giang
P3 13 Lạc Phúc Sơn Ờ Ba Vì - Hà Nội
P4 15 Lạc Phong Vân Ờ Ba Vì - Hà Nội
P5 16 Lạc Sơn đông- Sơn Tây- Hà Nội
P6 20 Cà chua An Lão- Hải Phòng
P7 27.3 Lạc Nho Quan Ờ Ninh Bình
P8 28 Lạc Yên Thuỷ Ờ Hoà Bình (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
P9 30 Lạc Diễn Châu Nghệ An
P10 32.2 Vừng Diễn Thịnh- Diễn Châu-
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 52
PHÂN TÍCH đA HÌNH ADN CỦA CÁC ISOLATE VI KHUẨN BẰNG
KỸ THUẬT RAPD
Hình 3.8. Kết quảựiện di sản phẩm RAPD của chủng vi khuẩn với mồi OPP19, OPH04, OPF10 vàM. Thang ADN chuẩn 1000bp OPP19, OPH04, OPF10 vàM. Thang ADN chuẩn 1000bp
ADN của 11 chủng vi khuẩn ựã ựược phân tắch với 10 mồi ngẫu nhiên. đánh giá tắnh ựa hình thông qua giá trị PIC, giá trị PIC càng lớn thì tắnh ựa hình của cặp mồi ựó càng cao, khoảng cách di truyền ựược xác ựịnh thông qua hệ số