III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.4. Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.1. Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng
3.4.1.1. Thu thập mẫu bệnh.
Mẫu bệnh ủược thu thập trờn khoai tõy tại Cao lộc Ờ Lạng Sơn, và trờn cà chua tại Phường 6 đà Lạt.
PLS: isolate phõn lập trờn khoai tõy thu thập tại Cao Lộc -Lạng Sơn PF6:isolate lập phõn trờn cà chua thu thập tại Phường 6 đà Lạt
+ Phương phỏp thu mẫu: chọn những mẫu bệnh ủiển hỡnh cũn tươi, mới ngoài ủồng ruộng và ủem về phũng phõn lập. Mẫu lỏ, thõn, quả bị bệnh cho vào tỳi nilon, ủiền etiket ủưa về phõn lập ngay hoặc bảo quản trong phũng 180C.
- Phương phỏp giỏm ủịnh và phõn lập nấm bệnh: theo phương phỏp của
Caten & Jinks 1968.
+ Cỏch tiến hành: Củ khoai tõy sạch bệnh rửa sạnh ủể khụ, khử trựng trờn ngọn lửa ủốn cồn, cắt thành lỏt mỏng khoản 5- 7mm. Cắt mẫu bệnh lấy phần tiếp giỏp giữa mụ bệnh và mụ khoẻ thành những mảnh nhỏ 1- 2mm khử trựng bằng soldilum hypochlorit 1% trong 3 phỳt (cồn 700) sau ủú rửa lại bằng nước cất vụ trựng, ủặt mẫu bệnh này vào giữa ủĩa petri, sau ủú ủặt lỏt cắt khoai tõy bờn trờn và giữ trong tủ ủịnh ụn với ủiều kiện nhiệt ủộ 180C và tối hoàn toàn.
Sau 5- 7 ngày sợi nấm phỏt triển ăn lờn mặt trờn của lỏt cắt khoai tõy, sau ủú ủưa lỏt cắt củ khoai tõy soi dưới kớnh hiển vi ủể xỏc ủịnh ủú cú phải là nấm phytophthora infestans hay khụng. Nếu ủỳng là nấm P. infestans thỡ sử dụng que cấy khờu sợi nấm chuyển sang mụi trường Pea- agar. Sau 7- 9 ngày khi nấm phỏt triển tốt trờn mụi trường này thỡ tiến hành cấy chuyển nấm sang mụi trường dinh dưỡng Pea- agar mới ủể thu ủược mẫu nấm thuần.
Cấy chuển bằng cỏch: Sử dụng buồng cấy nấm ủó ủược khử trựng sạch sẽ, que cấy ủó hơ trờn ngọn lửa ủốn cồn sau ủú cắt một thạch trờn cú chưa sợi
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 31
nấm chuyển sang mụt trường Pea- agar mới, sau ủú sử dụng giấy parafilm quấn quanh hộp Petri ủể trỏnh tạp. Sau 7- 9 ngày kiểm tra lần cuối cựng ta thấy sợi nấm P. infestans mọc trờn ủĩa mới và tản nấm mọc ủều kiểm tra lần này chắc chắn là nấm P. infestans vậy là thu ủược mẫu nấm P. infestans thuần ủể bắt ủầu tiến hành làm thớ nghiệm.
Danh sỏch cỏc isolate sử dụng trong thớ nghiệm:
Isolate Nguồn cõy ký chủ địa ủiểm lấy mẫu PLS Khoai tõy Cao Lộc- Lạng Sơn
PF6 Cà chua Phường 6- Thỏi Phiờn- đà Lạt - Cỏc loại mụi trường ủể nuụi cấy nấm Phytophthora infestans
+ Mụi trường V8
+ Pea- agar (ủậu Hà Lan) + Rye B- agar (lỳa mỳ) + Mụi trường Mix
3.4.1.2. Phương phỏp lõy bệnh nhõn tạo và ủếm bào tử
Thu bào tử nấm ở mụi trường nhõn tạo: Lấy mẫu bệnh thuần thu ủược Sau ủú thu bào tử cho vào hộp petri với 1-3ml nước cất, dựng que thuỷ tinh ủó ủược uốn cong hỡnh tam giỏc cà nhẹ trờn bề mẫu bệnh cho bào tử tỏch ra khỏi sợi nấm và chắt dịch ủú ra hộp petri mới và dựng lam ủể ủếm bào tử.
- Chuẩn bị lỏ cà chua: lỏ cà chua làm thớ nghiệm ủược cắt từ nhà lưới từ sỏng (trước 10h sỏng), lấy những lỏ tốt nhất (lỏ sạch), khụng cú dấu hiệu bị bệnh, ủủ tiờu chuẩn (khụng lấy những lỏ già) ủể thực hiện lõy bệnh trong phũng thớ nghiệm.
- Lỏ cà chua ủể nguyờn lỏ ủơn ủược ủặt ỳp trong hộp xốp sạch, trong hộp cú lớp giấy lọc ẩm. Mỗi giống ủược lõy nhiễm 5 cỏ thể, mỗi cỏ thể lõy nhiễm nhắc lại 5 lần/isolate, mỗi lần nhắc lại lõy nhiễm 4 lỏ ủơn và 1 lỏ làm ủối chứng khụng lõy nhiễm. Pha 1ml chứa 10.000 bào tử (Sporangia) và lõy nhiễm bằng cỏch nhỏ 20àl dung dịch ủó ủược pha vào chớnh giữa lỏ, sau ủú
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 32
dựng giấy chuyờn dụng cố ủịnh. Dựng tỳi linon bọc kớn ủể trỏnh bị lẫn tạp và giữ ẩm (ủộ ẩm 100%) sau ủú ủể trong phũng cú nhiệt ủộ 170- 180C. Sau hai ngày chiếu sỏng bằng ủốn 12 giờ sỏng và 12 giờ tối.
- Tiến hành ủỏnh giỏ cho ủiểm sau 6 ngày lõy nhiễm trờn lỏ ủơn. Cho ủiểm theo thang ủiểm từ 1- 6:
điểm Mức ủộ lỏ nhiễm bệnh (%) 1 Khụng cú triệu trứng 2 Xuất hiện cỏc chấm nhỏ trờn lỏ 3 Vết bệnh cú ủường kớnh chỗ lớn nhất khụng quỏ 1 cm 4 Vết bệnh lan rộng ~ 1,5 cm 5 Vết bệnh lan rộng ~ 50% diện tớch lỏ 6 Trờn 60% diện tớch lỏ bị bệnh
3.4.2. Phương phỏp nghiờn cứu ngoài ủồng ruộng
3.4.2.1. Cỏc giai ủoạn sinh trưởng của cõy cà chua trờn ủồng ruộng
+ Thời gian từ trồng ủến khi ra hoa:
+ Thời gian từ trồng ủến ủậu quả:
+ Thời gian từ trồng ủến khi quả bắt ủầu chớn + Thời gian từ trồng ủến chớn rộ.
3.4.2.2. Một số chỉ tiờu về sinh trưởng và cấu trỳc cõy
- Tốc ủộ sinh trưởng chiều cao thõn chớnh (cm): 7 ngày ủo 1 lần.
- Tốc ủộ ra lỏ trờn thõn chớnh: đếm số lỏ trờn thõn chớnh, 7 ngày theo dừi 1 lần. - Chiều cao từ gốc ủến chựm hoa ủầu tiờn (cm)
- Số ủốt từ gốc ủến chựm hoa ủầu tiờn (ủốt)
- Chiều cao cõy cuối cựng: ủo bằng thước dõy từ cổ rễ ủến ủỉnh sinh trưởng (cm). - Mức ủộ phõn cành ủỏnh giỏ theo cỏc mức:
+ Phõn cành mạnh + Phõn cành trung bỡnh + Phõn cành yếu
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 33
- Màu sắc lỏ: Xanh ủậm, xanh, xanh sỏng
3.4.2.3. Một số ủặc ủiểm về hỡnh thỏi và ủặc ủiểm nở hoa
- Dạng chựm hoa:
+ đơn giản: hoa ra trờn 1 nhỏnh chớnh. + Trung gian: hoa ra trờn 2 nhỏnh chớnh. + Phức tạp: chựm hoa chia thành nhiều nhỏnh.
- đặc ủiểm nở hoa: Quan sỏt và phõn ra nở hoa rộ tập trung hay nở hoa rải rỏc.
3.4.2.4. Năng suất và cỏc yếu tố cấu thành năng suất
- Tỷ lệ ủậu quả = (số quả ủậu / số hoa) ì 100%
Theo dừi trờn 5 chựm hoa ủầu của cõy (từ dưới lờn), tớnh tỷ lệ ủậu quả trờn từng chựm và tỷ lệ ủậu quả trung bỡnh.
- Số chựm quả trờn cõy (chựm): ủếm tổng số chựm quả - Tổng số quả trờn cõy (quả).
- Khối lượng trung bỡnh quả (gam). - Năng suất cỏ thể.
- Năng suất quả/ ụ thớ nghiệm.
3.4.2.5. đặc ủiểm hỡnh thỏi quả và chất lượng quả
- Chiều cao quả (cm): H - đường kớnh quả (cm): D - Dạng quả: I = H/ D
I > 1: Dạng quả dài I = 0,8-1: Dạng quả trũn I < 0,8: Dạng quả dẹt
- độ dày thịt quả (mm): đo bề dày thành thịt quả (bằng thước panme) - Số ngăn hạt trờn quả
- độ chắc quả: Rất mềm, mềm, chắc, cứng ủược ủỏnh giỏ bằng cảm quan. độ chắc quả (theo Kader và Morris, 1996) cú cỏc mức sau ủõy:
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 34
+ Rất cứng: Quả khụng bị múp khi ấn mạnh bằng tay, khi thỏi lỏt khụng mất nước hay hạt.
+ Cứng: Quả chỉ bị múp nhẹ khi ấn tay, thỏi khụng mất nước hay hạt. + Chắc: Quả bị múp khi ấn tay mạnh vừa, khi thỏi cú rơi một ớt nước và hạt. + Mềm: Quả bị múp khi ấn nhẹ tay, khi thỏi chảy nhiều nước và hạt. + Rất mềm (nhóo): Quả dễ múp khi ấn nhẹ, khi thỏi chảy nhiều nước và hạt. - Màu sắc quả khi quả cũn xanh: xanh, xanh nhạt, trắng ngà.
- Màu sắc quả khi chớn: vàng, ủỏ vàng, ủỏ bỡnh thường, ủỏ cờ, ủỏ thẫm.
3.4.2.6. Một số chỉ tiờu về phẩm vị ăn tươi
- đỏnh giỏ khẩu vị nếm theo cỏc mức: chua, chui dịu, nhạt, ngọt dịu, ngọt, ngọt ủậm.
- đỏnh giỏ hương vị quả: cú hay khụng hương vị thơm ủặc trưng của cà chua hoặc cú hương vị phụ khỏc (hăng).
- đặc ủiểm thịt quả: Chắc sương, chắc mịn, chắc bở, mềm mịn, mềm nỏt. - độ ướt thịt quả: dựng dao cắt ngang quả và quan sỏt:
+ Ướt: mặt thịt quả ướt, nghiờng khụng cú dịch quả chảy ra. + Khụ nhẹ: mặt thịt quả lấm tấm dịch quả.
+ Khụ: mặt thịt quả rỏo nước.
- 4 chỉ tiờu ủỏnh giỏ theo phương phỏp do Trung tõm Nghiờn cứu và Phỏt triển giống rau chất lượng cao đại học Nụng nghiệp Hà Nội ủưa ra
- Xỏc ủịnh hàm lượng chất khụ hũa tan (ủo ủộ Brix %) bằng dụng cụ cầm tay.
3.4.2.7. Tỡnh hỡnh nhiễm một số sõu bệnh hại chớnh
* Bệnh mốc sương (Phytophthora infestans) và ủược ủỏnh giỏ theo 7 cấp: 0: Khụng cú triệu trứng
1: 1-10% cõy bị bệnh 2: 10-20 % lỏ bị bệnh
3: 20- 40 % lỏ bị bệnh (1-10% cành bị bệnh) 4: 40-70 % lỏ bị bệnh(11-50% cành bị bệnh)
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 35
5: 70% -90 % lỏ bị bệnh (51- 100% cành bị bệnh) 6: 90%- 100% lỏ bị bệnh (cõy chết)
* Bệnh virus: Xỏc ủịnh theo biểu hiện triệu chứng trờn cõy. được phõn ra hai nhúm.
- Triệu chứng nhẹ gồm: dạng khảm lỏ, xoăn xanh ngọn.
- Triệu chứng nặng gồm: Dạng xoăn lỏ Ờ biến vàng, xoăn lựn, là dạng sợi (dương xỉ). đỏnh giỏ vào 25, 33, 40, 47 ngày sau trồng.
* Bệnh chết hộo cõy (hộo xanh): Xỏc ủịnh số cõy bị bệnh trờn tổng số cõy ở ụ thớ nghiệm.
Riờng với bệnh virus, hộo xanh vi khuẩn ủược tớnh bằng % số cõy bị hại