L ời cảm ơn
3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TRONG PHÒNG
3.3.2.1. Phương pháp chẩn đốn, phân ly, nuơi cấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum
+ Phương pháp chẩn đốn nhanh bệnh HXVK: lấy mẫu cây bệnh cĩ triệu chứng điển hình, cắt ngang đoạn thân sát gốc dài 3-5cm, đặt trong cốc nước vơ trùng sau 10 phút đem ra quan sát thấy cĩ dịch vi khuẩn mầu trắng sữa tiết ra ở đầu vết cắt và dịch ở trong cốc nước (Mc Carter S. M, 1991)[88].
+ Phân lập vi khuẩn: Dùng que cấy vi khuẩn đã khử trùng trên ngọn lửa
đèn cồn, lấy một vịng dịch trên bề mặt cắt của thân cây bệnh cấy trên mơi trường TZC (Kelman, A, 1954) [78]. Nuơi cấy trong điều kiện nhiệt độ 30-320C, theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau 24, 48 giờ, các khuẩn lạc riêng rẽ hình khơng đều, rìa nhầy trắng sữa, ở giữa cĩ phớt hồng nhạt. Cấy truyền vi khuẩn trên mơi trường
SPA, theo dõi sự phát triển của vi khuẩn trên mơi truờng: Khuẩn lạc cĩ mầu trắng kem, bề mặt ướt đĩ là vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuần khiết.
3.3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phát triển của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
+ Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy: Nuơi cấy vi khuẩn trên 5 mơi trường nhân tạo là TZC, SPA, PGA, King B, Wakimoto. Mỗi mơi trường cấy 3 hộp, mỗi hộp cấy 3 điểm. ðặt thí nghiệm trong tủđịnh ơn với nhiệt độ 30-320C.
+ Ảnh hưởng của pH mơi trường: Thí nghiệm được tiến hành trên mơi trường SPA với ngưỡng pH từ 5,5-8,5. Mỗi ngưỡng cấy 3 hộp, mỗi hộp cấy 3
điểm. ðặt thí nghiệm trong tủđịnh ơn với nhiệt độ 30-320C.
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ: Thí nghiệm được tiến hành trên mơi trường SPA cĩ pH = 7,0. ở mỗi điều kiện nhiệt độ cấy vi khuẩn trên 3 hộp, mỗi hộp cấy 3 điểm. ðặt thí nghiệm trong các điều kiện nhiệt độ: 22-240C; 26-280C; 30-320C; 34-360C; 38-400C.
Chỉ tiêu: theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc (mm) vi khuẩn ở các yếu tố thí nghiêm sau 24, 48, 72 giờ nuơi cấy.
3.3.2.3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc của các Isolates vi khuẩn Ralstonia solanacearum
+ Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc: Cấy các isolate vi khuẩn trên 3 mơi trường: TZC, SPA, Kings’B, đặt trong điều kiện nhiệt độ thích hợp 30-320C.
Chỉ tiêu: Quan sát, theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn, màu sắc bề mặt khuẩn lạc, tốc độ phát triển của vi khuẩn sau 24, 48 và 72 giờ nuơi cấy (Kelman, A, 1997)[81].
+ Phương pháp nghiên cứu hình thái tế bào của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Chúng tơi tiến hành nhuộm và quan sát tế bào vi khuẩn theo phương pháp nghiên cứu của Nishizawa Kangen và Hucker (Schaad, N.W, 1998)[105].
3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm trong nhà lưới
3.3.3.1. Khảo sát khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của một số giống cà chua trong nhà lưới cà chua trong nhà lưới
+ Các giống cà chua sử dụng trong thí nghiệm: Savior, VL2922, VL2500, BM199, TN005, 609, 607, HT7, PT18, DV2962.
+ Nguồn vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm: isolate vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua phân lập ở Gia Thắng – Gia Viễn – Ninh Bình.
+ Ngâm hạt cà chua trong dung dịch vi khuẩn nồng độ 108-109 cfu/ml trong 30 phút trước khỉ gieo.
+ ðất sử dụng trong thí nghiệm là đất phù sa đã đựơc khử trùng ở nhiệt
độ 120-1400C trong 30 phút.
+ Mỗi giống cà chua được gieo trên 3 chậu, mỗi chậu 10 cây.
Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%) sau 25, 30, 35 ngày sau gieo.
3.3.3.2. Nghiên cứu tính gây bệnh của các dịng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên các cây ký chủ khác nhau solanacearum phân lập trên các cây ký chủ khác nhau
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành lây nhiễm với 4 lồi cây trồng cà chua, lạc, cà pháo, khoai tây trên nền đất phân đã được khử trùng, bằng 4 Isolates vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên cà chua, cà pháo, lạc, khoai tây ở tỉnh Ninh Bình. Mỗi Isolates là một cơng thức, mỗi cơng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 30 cây.
Lây nhiễm bằng phương pháp sát thương rễ: Sát thương về một phía, sâu 2cm, rộng 3cm.
3.3.3.3. Khảo sát khả năng phịng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua bằng vi khuẩn đối kháng trong điều kiện chậu vại
Thí nghiệm thực hiện trong chậu vại, với giống cà chua P375, trên nền
đất phù sa + phân chè.
Cơng thức 1 (CT1): ðối chứng (Sát thương rễ và xử lý 10ml dung dịch vi khuẩn R. Solanacearum khi cây cà chua được 20 ngày tuổi).
Cơng thức 2 (CT2): Sát thương rễ sau đĩ xử lý (tưới dịch) cùng lúc 10ml dung dịch vi khuẩn R. solanacearum + 10 ml dung dịch vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis.
Cơng thức 3 (CT3): Xử lý (tưới dịch) 10 ml dung dịch vi khuẩn
Bacillus subtilis khi cây cà chua đươc 18 ngày tuổi; Khi cây cà chua được 20 ngày tuổi tiến hành sát thương rễ và xử lý 10 ml dung dịch vi khuẩn R. Solanacearum.
Cơng thức 4 (CT4): Sát thương rễ và xử lý (tưới dịch) 10 ml dung dịch vi khuẩn R. Solanacearum khi cây cà chua đươc 18 ngày tuổi; Khi cây cà chua được 20 ngày tuổi tiến xử lý 10 ml dung dịch vi khuẩn Bacillus subtilis.
Nồng độ dung dịch vi khuẩn R. solanacearum và Bacillus subtilis dùng trong thí nghiệm từ 108-109 cfu/1ml.
Mỗi cơng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 30 cây.
Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%) sau 5, 10, 15 lây nhiễm.
3.3.3.4. Nghiên cứu tính độc của các isolate vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập được trên các cây ký chủ
Trồng cây ký chủ (cà chua, lạc, cà pháo, khoai tây) trên nền đất phù sa. Khi các cây ký chủ đạt tiêu chuẩn lây nhiễm, ta tiến hành lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp sát thương rễ (dùng dao sạch sát thương về một phía sâu
Mỗi cơng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lân nhắc lại 30 cây.
Chỉ tiêu theo dõi: số cây bị bệnh sau 10 ngày lây nhiễm, tính tỷ lệ bệnh.
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được tính sai số về S2, LSD, CV%... theo chương trinh xử lý thống kê Anova trong bảng tính Exel.
4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. ðiều tra đánh giá mức độ phổ biến và tác hại của bệnh HXVK hại một số cây trồng ở Ninh Bình
Bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng, phổ biến rộng rãi và điển hình nhất
ở vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới và những vùng cĩ khí hậu ấm áp trên thế giới (Hayward, A. C. 1986)[63]. Cho tới nay bệnh HXVK được ghi nhận là loại bệnh nghiêm trọng đứng hàng đầu trong số các loại bệnh hại do vi khuẩn gây ra (Kelman, A. 1997)[81].
Việt Nam là nước nhiệt đới, cĩ khí hậu nĩng ẩm. Theo ðỗ Tấn Dũng, 1998[10], Việt Nam nằm ở vùng phân bố của lồi vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Lê Lương Tề, 1997[23] "Bệnh HXVK hại một số cây trồng như cà chua, khoai tây, thuốc lá, lạc, cà… là một trong những bệnh hại phổ
biến, phát sinh, phát triển và gây hại ở nhiều vùng trồng trọt".
Bệnh HXVK là một trong những nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất, sản lượng trên nhiều loại cây trồng phổ biến như cà chua, khoai tây, thuốc lá, lạc… Những nghiên cứu trong và ngồi nước cho thấy bệnh HXVK là vấn đề nan giải, rất khĩ phịng trừ bằng một biện pháp riêng rẽ, kể cả thuốc hố học.
Trong những năm gần đây, diện tích trồng rau màu ở Ninh Bình ngày càng mở rộng và phát triển với nhiều chủng loại giống cây trồng. Cũng như
các vùng trồng rau khác trên cả nước, bệnh HXVK là nguyên nhân chính làm giảm năng suất và thu hẹp diện tích trồng rau màu của một số vùng. ðể tìm hiểu tình hình, mức độ phổ biến và đặc điểm phát sinh gây hại của bệnh HXVK, chúng tơi tiến hành điều tra, khảo sát mức độ bệnh HXVK trên một số cây trồng cạn phổ biến ở tỉnh Ninh Bình.
Cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) cĩ nguồn gốc tại Peru và
được đưa đến Châu Âu vào thế kỷ 16 (Jones và CTV, 1991)[76]. ðến nay cây cà chua la loại rau phổ biến ở nhiều nước, chiếm vị trí thứ hai sau khoai tây. Cà chua là cây rau ăn quả cao cấp, cung cấp cho cơ thể hàng ngày lượng Vitamin, khống chất và các dưỡng chất quan trọng khác. Theo số liệu của Fao (2001), diện tích trồng cà chua trên thế giới trung bình khoảng 3,7 triệu ha/năm, sản lượng khoảng 100 triệu tấn.
Ở các tỉnh thuộc ðồng bằng sơng Hồng ngồi mùa hè cĩ nhiệt độ cao,
ẩm độ lớn ảnh hưởng rất lớn đến quá trình thụ phấn, thụ tinh vì vậy tỷ lệđậu quả và chất lượng quả khơng cao, đặc biệt là ảnh hưởng của bệnh HXVK làm giảm năng suất nghiêm trọng, cây cà chua được trồng hầu hết ở các thời vụ
cịn lại Chu Văn Chuơng, 2005[3]. Bệnh HXVK trên cà chua và một số cây trồng khác đã được nhiều tác giả trong nước đề cập đến.
Nhằm tìm hiểu tình hình bệnh HXVK ở một số vùng trồng cà chua chính của tỉnh Ninh Bình, chúng tơi tiến hành điều tra tình hình, mức độ phổ
biến của bệnh HXVK. ðể thuận lợi cho việc đánh giá, so sánh mức độ hại của bệnh HXVK hại cà chua chúng tơi tiến hành điều tra ở cả 3 vụ trồng cà chua ở
Ninh Bình năm 2007 – 2008.
ðiều tra trên đồng ruộng chúng tơi dựa vào triệu chứng điển hình của bệnh biểu hiện ra bên ngồi.
Cây thể hiện triệu chứng ngay sau khi bị vi khuẩn xâm nhập vào rễ
hoặc phần thân sát mặt đất. Ban ngày lá cây bị bệnh mất màu nhẵn bĩng, tái xanh héo cụp xuống, nhưng vào chiều mát hoặc ban đêm cĩ thể phục hồi lại, nhưng chỉ sau 2 đến 3 ngày cây khơng thể phục hồi được. Trong thời kỳđầu cây bị bệnh cĩ thể héo rũ một cành hoặc một vài cành, sau đĩ héo rũ tồn cây, dẫn tới héo xanh và chết. ðể chẩn đốn bệnh HXVK hại cà chua, cắt đoạn
gốc thân bị bệnh, nhúng vào cốc nước vơ trùng sau một vài phút nếu thấy dịch trắng sữa chảy trong cốc và đầu lát cắt, cho phép kết luận mẫu cây cà chua bị
bệnh héo do lồi Pseudomonas solanacearum (Mc. Carter, S.M. 1991)[88]
ðể đánh giá mức độ phổ biến của bệnh, chúng tơi đã tiến hành chọn một số điểm điều tra đại diện cho các vùng trồng cà chua ở Ninh Bình: Gia Vượng; Gia Thắng của huyện Gia Viễn; Ninh Sơn, TP. Ninh Bình; Khánh Nhạc, Yên Khánh. ðiều tra ở giai đoạn quả non- quả già, đây là giai đoạn cao
điểm của bệnh HXVK hại cà chua.
Vụ thu đơng cĩ thời gian từ tháng 8 đến tháng 12 với đặc điểm nhiệt độ
và độ ẩm cĩ xu hướng hạ thấp vào cuối vụ. Cây con được gieo vào tháng 8, trồng vào cuối tháng 8 và ra hoa vào tháng 9. Tháng 8 thường cĩ mưa rào lớn và nhiệt độ cao đây là điều kiện thuận lợi cho sự phát sinh, phát triển của bệnh HXVK. Trong các vụ trồng cà chua thì vụ thu đơng bệnh HXVK thường gây hại nặng nhất, nếu bị nhiễm bệnh vào đầu vụ thì tỷ lệ chết xanh rất cao. Vì vậy các hộ nơng dân khơng dám mạo hiểm trồng cà chua. Tuy nhiên trong những năm gần đây diện tích trồng cà chua thu đơng ở Ninh Bình ngày càng
được trồng nhiều ở một số vùng trồng rau trọng điểm do giá thành cà chua trong vụ này thường cao hơn rất nhiều so với các vụ khác trong năm. Kết quả điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua vụ thu đơng năm 2007
Bảng 4.1: Mức độ phổ biến của bệnh HXVK (Ralstonia solanacearum
Smith) hại cà chua vụ thu đơng ở tỉnh Ninh Bình năm 2007 STT ðịa điểm điều tra Giống Sốđiểm điều tra TLB trung bình (%) 1. 2. 3. 4. 5. Gia Vượng-G. Viễn Gia Thăng-Gia Viễn Ninh Sơn-TP. Ninh Bình Gia Thắng-Gia Viễn Khánh Nhạc-Yên Khánh VL2500 VL 2500 VL2500 TN005 VL2500 16 16 14 10 12 8,6 13,3 8,5 12,9 6,4 Ghi chú: ðiều tra ở giai đoạn cây cà chua quả non- quả già
Ảnh 4.2: Triệu chứng bĩ mạch cây cà chua bị bệnh héo xanh vi khuẩn
Ralstonia solanacearum Smith
Ảnh 4.4. Dịng dịch vi khuẩn trong phương pháp xác định nhanh bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith
Từ kết quả điều tra chúng tơi nhận thấy bệnh HXVK là bệnh gây hại phổ biến trên cà chua vụ thu đơng. Bệnh phát sinh, phát triển và gây hại khá nghiêm trọng và cao nhất ở Gia Thắng, Gia Viễn trên cả hai giống cà chua trồng chính là VL2500 ( TLB là13,3%) và TN005 ( TLB là 12,9%), tỷ lệ bệnh thấp nhất ở Khánh Nhạc- Yên Khánh trên giống VL2500 là 6,4%.
Trong qua trình điều tra chúng tơi nhận thấy Gia Thắng là vùng cĩ chân
đất cao, thường khơng luân canh với lúa nước. ðây là điều kiện thuận lợi cho sự tồn tại nguồn vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở trong đất. Theo kết quả
nghiên cứu của một số tác giả cho thấy: Luân canh cà chua với cây lúa tỷ lệ
nhiễm bệnh HXVK sẽ giảm đáng kể (Prior et al. 1993 [102]; Enfinger. 1979 [51]). Ngồi ra các nghiên cứu từ Philipin, Ấn ðộ (Ramesh et al. 1992 [104]) cho rằng luân canh cây họ cà với cây một lá mầm như lúa, ngơ, mía tỷ lệ
nhiễm bệnh HXVK giảm đáng kể.
Vụ đơng xuân (chính vụ) là vụ trồng cà chua phổ biến nhất được trồng từ tháng 10 đến tháng 2 năm sau. ðây là thời vụ mà các yếu tố tự nhiên như
nhiệt độ, lượng mưa và độ ẩm thấp, sâu bệnh hại ít, rất thuận lợi cho cây cà chua sinh trưởng, phát triển và cho năng suất cao nhất trong năm. Với điều kiện thời tiết vụ này ở miền bắc lạnh và khơ khơng thuận lợi cho sự phát sinh phát triển của bệnh HXVK. Vì vậy đây là vụ cĩ sản lượng cao và được trồng với diện tích lớn nên thường cung vượt cầu, giá bán sản phẩm thấp, khĩ tiêu thụ. Những năm gần đây diện tích trồng cà chua trong vụ này cĩ xu hướng giảm, do thu nhập của người trồng cà chua thường khơng cao. Kết quả điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua vụ đơng xuân được thể hiện
ở bảng 4.2.
Kết quả điều tra cho thấy bệnh héo xanh vi khuẩn là bệnh hại phổ biến
ở các vùng trồng cà chua ở tỉnh Ninh Bình. Tuy nhiên đây là vụ cĩ tỷ lệ bệnh thấp, tỷ lệ bệnh cao nhất của các vùng điều tra là 2,7% và thấp nhất là 1,7%.
Từ kết quả trên cĩ thể thấy đây là vụ thuận lợi cho sản xuất cà chua đối với bệnh HXVK.
Bảng 4.2. Mức độ phổ biến của bệnh HXVK (Ralstonia solanacearum
Smith) hại cà chua vụđơng xuân ở tỉnh Ninh Bình năm 2007 – 2008
STT ðịa điểm điều tra Giống Sốđiểm điều tra TLB trung bình (%) 1. 2. 3. 4. 5. Gia Vượng-G. Viễn Gia Vượng-G. Viễn Gia Thắng - Gia Viễn Gia Thắng - Gia Viễn Ninh Sơn-TP. Ninh Bình 609 TN005 TN005 VL2500 VL2500 12 8 14 12 14 1,7 1,8 2,1 2,7 2,4 Ghi chú: ðiều tra ở giai đoạn cây cà chua quả non- quả già
Vụ xuân hè là thời vụ cây cà chua được gieo hạt vào đầu xuân (tháng 2), cây cà chua được trồng khi cây con được khoảng 3 tuần tuổi. Cây cà chua