Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 3.1 Đối t−ợng nghiên cứu
Trứng trâu, bò, lợn thu đ−ợc từ các buồng trứng t−ơng ứng, với điều kiện buồng trứng thu mẫu phải hoàn toàn bình th−ờng, không bị thiểu năng, không bị viêm nhiễm.
Các buồng trứng thu đ−ợc từ một số lò mổ tập trung, phân theo hai mùa, mùa xuân (tháng 2,3,4), mùa hè (tháng 5,6,7).
Buồng trứng thu đ−ợc từ trâu, bò 4 - 10 năm tuổi, lợn từ 5 - 6 tháng tuổi. Một số môi tr−ờng cần thiết: môi tr−ờng bảo quản trứng khi vận chuyển, môi tr−ờng nuôi thành thục tế bào trứng.
Các thiết bị, máy móc phòng thí nghiệm cần thiết. 3.2 Nội dung nghiên cứu
1. Khảo sát khối l−ợng, kích th−ớc của buồng trứng trâu, bò, lợn: khối l−ợng, kích th−ớc: chiều dài, chiều rộng, bề dày của buồng trứng, từ đó nghiên cứu ảnh h−ởng của yếu tố mùa vụ thu trứng lên khối l−ợng, kích th−ớc của các buồng trứng.
2. Khảo sát về số l−ợng nang trên bề mặt buồng trứng. Số l−ợng nang 2mm và số l−ợng nang <2mm trên bề mặt buồng trứng trâu, bò, lợn, từ đó nghiên cứu ảnh h−ởng của yếu tố mùa vụ lên số l−ợng, kích th−ớc các nang trứng.
3. Khảo sát và phân loại chất l−ợng trứng tr−ớc khi nuôi thành thục. Thu trứng từ các nang trứng có kích th−ớc 2mm, phân loại chất l−ợng trứng A, B, C theo Leibfried - Rutledge (1979)[28].
4. Nghiên cứu ảnh h−ởng của mùa vụ thu trứng (mùa xuân, mùa hè) lên kết quả nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn.
3.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu
Các ph−ơng pháp thu mẫu buồng trứng, phân loại trứng, nuôi thành thục và đánh giá kết quả nuôi thành thục R. Ruhege (1979), H. Kikuchi. (2002) với cải biên do phòng công nghệ phôi thực hiện.
Các thao tác trong phòng thí nghiệm phải hoàn toàn vô trùng trong tủ vô trùng với các dụng cụ luôn đ−ợc khử trùng thật kỹ tr−ớc khi dùng.
3.3.1 Ph−ơng pháp thu, bảo quản và vận chuyển buồng trứng
Tại lò mổ, buồng trứng đ− ợc thu ngay khi gia súc bị giết, buồng trứng đựơc rửa sạch 3 - 4 lần bằng dung dịch n−ớc muối sinh lý có bổ sung kháng sinh và ngâm vào dung dịch bảo quản mẫu Photphate Buffered Saline (PBS) đ chuẩn bị sẵn ở nhiệt độ từ 30 - 350C. Sau đó toàn bộ mẫu thu đ−ợc đặt trong bình ổn nhiệt 30 - 350C, trong suốt quá trình vận chuyển từ lò mổ về phòng thí nghiệm.
Thời gian từ lúc gia súc bị giết cho đến khi tiến hành xử lý thu trứng tại phòng thí nghiệm, trong vòng 1 - 2giờ đối với trứng lợn, 2 - 4 giờ đối với trứng trâu, bò.
M ôi tr−ờng PBS có thành phần nh− sau (dùng pha trong 1 lít) (Nguyễn Hữu Đức, 2005)[5].
Hóa chất Khối l−ợng (gam)
NaCl 8 Na pyruvate 0,036 KCl 0,2 Na2HPO4 1,15 KH2PO4 0,2 Glucose 1 MgCl2.6H2O 0,1 CaCl2.2H2O 0,1 Penicilline 100000UI Streptomycine 50mg Bovin Serum Albumine 2 - 4
3.3.2 Phân loại nang bề mặt buồng trứng
Từng buồng trứng đ−ợc gắp ra. Đếm số nang bề mặt buồng trứng và phân loại theo đ−ờng kính của chúng. Các nang trên bề mặt buồng trứng đ−ợc phân làm 3 cấp FD (Follicle Diameter) (Nguyễn Hữu Đức vcs, 2005)[5].
Cấp 1 đ−ờng kính nang nhỏ (FD) < 3 mm Cấp 2 đ −ờng kính nang trung bình 3 mm (FD) 5 mm Cấp 3 đ− ờng kính nang lớn (FD) >5 mm
3.3.3 Phân loại trứng theo chất l−ợng
Các trứng sau khi đ− ợc rửa sạch trong M - 199 sẽ đ−ợc phân loại dựa vào hình thái các lớp tế bào hạt bao quanh tế bào trứng (Leibfried - Rutledge 1979)[28].
Trứng loại tốt (A) có từ 4 - 5 lớp tế bào hạt trở lên bao quanh tế bào trứng, các lớp tế bào hạt này dày đặc, đều đặn, đồng nhất và chúng liên kết chặt chẽ với nhau.
Trứng loại khá (B) bao quanh trứng là 2 - 3 lớp tế bào hạt, các lớp tế bào này có thể không dày đặc nh− ở loại A nh−ng vẫn dày đặc và đều đặn.
Trứng loại xấu (C) trứng trần hoàn toàn không có lớp tế bào hạt bao quanh, nguyên sinh chất màu tối, co lại và phân d, hoặc trứng bị tr−ơng to.
3.3.4 Ph−ơng pháp nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm
Trứng sau khi đánh giá, phân loại đ −ợc đ −a vào nuôi thành thục ở các thời điểm 24 giờ với trứng trâu bò, 36 - 72 giờ với trứng lợn.
Môi tr−ờng nuôi thành thục trứng lợn (MAT), đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu này là môi tr−ờng tổng hợp gồm hai môi tr−ờng là MAT - I có bổ
xung hormon và MAT - II không bổ sung hormon. Môi tr−ờng đ−ợc nạp tr−ớc vào đĩa nhựa petri, các giọt nuôi đ−ợc phủ dầu khoáng vô trùng và đ− a vào tủ nuôi 5% CO2 ở 38,5 - 390C, độ ẩm không khí bo hoà, tối thiểu 2 giờ tr−ớc khi đ−a trứng vào nuôi.
Đánh giá sự thành thục của trứng dựa vào hiện t−ợng bông tơi của các tế bào cumulus, ở 48 giờ với lợn, ở 24 giờ với trâu, bò và sự xuất hiện thể cực thứ nhất.
3.3.5 Đ ánh giá các giai đoạn phát triển nhân của tế bào trứng
Để đánh giá chính xác các giai đoạn phát triển nhân của tế bào trứng tại thời điểm hút trứng ra khỏi buồng trứng, cần tiến hành tách toàn bộ lớp tế bào cumulus bao quanh trứng trên máy vortex.
Trứng đ−ợc cố định trong dung dịch ethanol: acid acetic và đ−ợc nhuộm bằng thuốc nhuộm orcein 1%, sau đó đ−ợc quan sát trên kính hiển vi olympus ở độ phóng đại 400 - 1000 lần. Trạng thái phát triển nhân của tế bào trứng đ−ợc đánh giá dựa trên trạng thái của nhân và nhiễm sắc thể theo chỉ dẫn của (Leibfried - Rutledge vcs, 1986)[29] và đ −ợc phân loại theo các giai đoạn sau: