5. ðịa ủiểm thực hiện
3.1.Kết quả phõn lập vi khuẩn Salmonella từ cỏc mẫu bệnh phẩm
Vi khuẩn Salmonella sống khắp nơi trong thiờn nhiờn, chỳng sống
trong ruột của ủộng vật khoẻ, từ ủú theo phõn ra mụi trường bờn ngoàị Tỏc dụng gõy bệnh của chỳng chỉ xuất hiện khi sức chống ủỡ của cơ thể yếu ủi, trong ủiều kiện vệ sinh thỳ y và chăm súc, nuụi dưỡng kộm. (Phan Thanh Phượng, 1988, [31]). Tỏc giả cũng cho biết: Tỷ lệ mắc bệnh Phú thương hàn thường tăng lờn vào thời kỳ lợn cai sữa, vỡ lỳc ủú cơ thể lợn con thay ủổi, dễ nhiễm bệnh. Trong trường hợp sức ủề khỏng của cơ thể tốt, hệ vi sinh vật cú lợi và cú hại ở trạng thỏi cõn bằng, khi ủiều kiện vệ sinh chăm súc tốt, dinh dưỡng ủầy ủủ thỡ bệnh khụng xảy rạ Ngược lại, trong ủiều kiện bất lợi thỡ bệnh dễ xảy ra và ủụi khi gõy tổn thất lớn, ủặc biệt là lợn ngay sau khi cai sữạ
Chỳng tụi ủó tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm kiểm tra ủối với lợn ốm và lợn chết cú biểu hiện triệu chứng và bệnh tớch nghi do vi khuẩn Salmonella gõy ra như: Phõn, chất chứa ruột, gan, lỏch, hạch màng treo ruột, mỏu tim, phổi, thận. Kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 3.1:
Bảng 3.1: Kết quả phõn lập vi khuẩn Salmonella từ bệnh phẩm Số TT Nơi gửi mẫu Số lượng mẫu (n) Kết quả phõn lập (+) Tỉ lệ (%) 1 Ba Vỡ 12 5 41,66 2 Chương Mỹ 56 21 37,50 3 Thạch Thất 17 2 11,76 4 Thường Tớn 15 9 60,00 5 Phỳ Xuyờn 45 10 22,22 6 Phỳc Thọ 20 11 55,00 Tổng 165 58 35,15
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ62
Qua bảng 3.1 cho thấy số mẫu tỡm thấy Salmonella là 58/165 chiếm tỷ
lệ 35,15 %.Tỷ lệ Salmonella tỡm thấy cao nhất ở Thường Tớn với 60% sau ủú là Phỳc Thọ (55%), thấp nhất ở Thạch Thất với 11,76%. Theo Nguyễn Thị Nội và cộng sự (1989) [27] ủiều tra tại 5 cơ sở chăn nuụi lợn cho biết:
Salmonella xuất hiện với tỷ lệ 41%, 51%, 82,8% và 2 cơ sở cú tỷ lệ nhiễm Salmonella 100%. Tạ Thị Vịnh và cộng sự (1996) [43] tỡm thấy Salmonella
với tỷ lệ nhhiễm 80-90% ở lợn ỉa chảỵ Nguyễn Bỏ Hiờn (2001) [16] phõn lập ủược vi khuẩn Salmonella ở 90,37% số mẫu phõn lợn bị tiờu chảỵ Theo Hồ Văn Nam và cộng sự (1997) [25] thỡ tỷ lệ lợn ở cỏc lứa tuổi nhiễm Salmonella dao ủộng từ 40-88,8%. Cự Hữu Phỳ và cộng sự (2000) [29] khi phõn lập vi khuẩn Salmonella ở 4 cơ sở chăn nuụi lợn miền Bắc cho thấy tỷ lệ trung bỡnh nhiễm Salmonella là 80%. Tạ Thị Vịnh và cộng sự (1997) [43] khi kiểm tra 65 mẫu phõn lợn bệnh tại một số vựng thuộc Ba Vỡ và Thường Tớn - Hà Tõy cho biết tỷ lệ nhiễm Salmonella là 70Ờ90%.Tuy nhiờn kết quả của chỳng tụi
phự hợp với kết quả nghiờn cứu của Phựng Quốc Chướng (1995) [2].
Kết quả nghiờn cứu này tiếp tục khẳng ủịnh vai trũ của vi khuẩn
Salmonella trong bệnh tiờu chảy của lợn sau cai sữa ở Việt Nam. Vấn ủề do Salmonella và bệnh do chỳng gõy ra ủó ủược thế giới khẳng ủịnh từ thế kỷ 18,
song ủến nay nú vẫn cũn nguyờn giỏ trị, thậm chớ ngày càng trở nờn phức tạp hơn. Bởi vậy việc nghiờn cứu về loại vi khuẩn này vẫn là vấn ủề cần thiết ủối với mỗi quốc gia (Selbitz H-J. và cộng sự, 1995[60]).
Kết quả phõn lập Salmonella lấy bệnh phẩm từ lợn ốm và chết cú ý nghĩa chớnh xỏc trong chẩn ủoỏn, cho phộp xỏc ủịnh bệnh và cú biện phỏp nhanh chúng phũng bệnh và chữa bệnh do vi khuẩn Salmonella gõy ra giảm mức thiệt hại (Phan Thanh Phượng, 1988) [31], (Selbitz H-J. và cộng sự., 1995) [60].
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ63
Việc tỡm thấy vi khuẩn hay khụng ở bệnh phẩm cũn phụ thuộc vào quỏ trỡnh sử dụng khỏng sinh trong phũng trị bệnh. Sử dụng khỏng sinh khụng thớch hợp, cũng như khụng ủỳng liệu trỡnh sẽ ảnh hưởng ủến quỏ trỡnh lõy lan cũng như thời gian thải vi khuẩn Salmonella ở lợn. Vấn ủề này cũng ủược nhiều nhà khoa học nghiờn cứụ Theo đào Trọng đạt (1996) [12], thỡ ủối với thể bệnh Phú thương hàn cấp tớnh, nhiễm trựng huyết ở lợn, nếu phỏt hiện sớm thỡ cú thể ủiều trị cú hiệu quả bằng những khỏng sinh cú tỏc dụng mạnh như Gentamycin, Kanamycinẹ.. Ngược lại với thể bệnh viờm ruột món tớnh do S. typhimurium thỡ ủiều trị bằng khỏng sinh khụng những khụng cú tỏc dụng mà cũn làm tăng cường ủộ cũng như kộo dài thời gian thải trựng, làm lõy lan mầm bệnh ụ nhiễm mụi trường và ụ nhiễm thực phẩm.
3.2. Kết quả xỏc ủịnh một số ủặc tớnh nuụi cấy và ủặc tớnh sinh hoỏ của chủng Salmonella phõn lập ủược.
Như chỳng ta ủó biết, mỗi loài vi khuẩn cú một số ủặc tớnh sinh học khỏc nhau như: Tớnh chất nuụi cấy trờn cỏc mụi trường thụng thường, mụi trường ủặc biệt, ủặc tớnh chuyển hoỏ cỏc loại ủường và khả năng sản sinh cỏc hợp chất sinh học trung gian khỏc trờn mụi trường nuụi cấy, trong quỏ trỡnh trao ủổi chất.
Trờn cơ sở ủú, chỳng tụi ủó tiến hành giỏm ủịnh cỏc loài vi khuẩn
Salmonella phõn lập ủược từ cỏc mẫu nghiờn cứụ
Kết quả thể hiện ở bảng 3.2 ;3.3 và 3.4.
Trong quỏ trỡnh nuụi cấy bệnh phẩm trực tiếp trờn cỏc mụi trường thạch ủặc hiệu là cỏc mụi trường MacConkey và mụi trường DHL phần lớn ủều tỏch ủược cỏc khuẩn lạc thuần khiết, nờn chỳng tụi ủó bỏ qua cụng ủoạn tăng sinh trờn mụi trường tăng sinh chọn lọc và khụng chọn lọc. Những mẫu cấy lần ủầu cho kết quả õm tớnh ủược tăng sinh ủể giỏm ủịnh lạị
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ64
Khi nuụi cấy vi khuẩn ở mụi trường lỏng vi khuẩn mọc rất tốt trong 24h mụi trường chưa cú màng nhưng sau 24h nuụi cấy ở 370C mụi trường ủục ủều, trờn bề mặt mụi trường cú vỏng.
Màu sắc khuẩn lạc: Trờn mụi trường thạch MacConkey khuẩn lạc khụng màu, trũn, nhẵn và hơi lồi ở giữạ Trờn mụi trường thạch DHL khuẩn lạc cú màu ủen, xung quanh trong suốt, hoặc khuẩn lạc trong suốt khụng màu trũn gọn, trơn nhẵn và hơi lồi ở giữa; 100% số chủng kiểm tra bắt màu Gram (-).
Bảng 3.2: Kết quả xỏc ủịnh một sốủặc tớnh nuụi cấy và hỡnh thỏi khuẩn lạc của cỏc chủng Salmonella phõn lập ủược
Mụi trường kiSố mẫu ểm tra đặc ủiểm Kết quả (+) Tỷ lệ %
Nước thịt 58 đục ủều, sau 24h mặt
MT cú màng mỏng 58 100
Thạch thường 58 Khuẩn lạc trong suốt, dạng S 58 100 Thạch
MacConkey 58 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khuẩn lạc trong suốt,
dạng S 58 100
Thạch DHL 58
Khuẩn lạc ở giữa ủen, xung quanh trong suốt, hoặc khuẩn lạc trong suốt khụng màu, dạng S
58 100
Nhuộm Gram 58 Trực khuẩn ngắn, 2 trũn, bắt màu Gr(-) ủầu 58 100
Ghi chỳ: - MT: Mụi trường
- S: Là dạng khuẩn lạc trũn, gọn, búng lỏng, trơn nhẵn và lồi Sau khi kiểm tra ủặc tớnh hỡnh thỏi và nuụi cấy của cỏc chủng
Salmonella trờn, chỳng tụi tiến hành kiểm tra một số ủặc tớnh sinh hoỏ củõ chỳng: Khả năng di ủộng, khả năng sinh H2S, Indol, phản ứng Oxydaza, phản ứng Catalazạ Kết quả ủược thể hiện ở bảng 3.3.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ65
Dựa vào kết quả nghiờn cứu chỳng tụi thấy tất cả cỏc chủng Salmonella phõn lập ủược ủều cú ủặc tớnh sinh hoỏ như: Sinh H2S, di ủộng, khụng sinh Indole, phản ứng Oxydaza õm tớnh, Catalaza dương tớnh.
Bảng 3.3: Kết quả xỏc ủịnh một sốủặc tớnh sinh hoỏ của vi khuẩn Salmonella phõn lập ủược Kết quả Phản ứng Số mẫu kiểm tra (+) Tỷ lệ (%) (-) Tỷlệ (%) Sinh H2S 58 58 100 Indole 58 58 100 Oxydaza 58 58 100 Catalaza 58 58 100 Di ủộng 58 58 100 Ghi chỳ: + : Phản ứng dương tớnh - : Phản ứng õm tớnh.
Bảng 3.4: Kết quả giỏm ủịnh khả năng lờn men ủường của cỏc chủng Salmonella phõn lập ủược. STT Cỏc loại ủường Số mẫu kiểm tra Kết quả Tỷ lệ % 1 Glucoz 58 +H 100 2 Manitol 58 +H 100 3 Dextronz 58 +H 100 4 Sarbitol 58 +H 100 5 Arabitol 58 +H 100 6 Galactoz 58 +H 100 7 Manit 58 +H 100 8 Mantol 58 +H 100 9 Sucroz 58 - - 10 Lactoz 58 - -
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ66
- : Phản ứng õm tớnh.
Qua bảng 3.4 chỳng tụi thấy tất cả cỏc chủng Salmonella phõn lập ủược ủều lờn men sinh hơi cỏc loại ủường như: Glucoz, Manitol, Galactoz, Manit, khụng lờn men Sucroz, Lactoz.
Kết quả ở cỏc bảng trờn cho thấy hỡnh thỏi của cỏc khuẩn lạc
Salmonella sp mọc trờn cỏc mụi trường MacConkey và DHL cũng như cỏc
ủặc tớnh sinh hoỏ như lờn men ủường và sinh hơi Glucoz, Sarbitol, khụng lờn men ủường Lactoz, sinh H2S và di ủộng là những ủặc tớnh quan trọng của cỏc loài Salmonella gõy bệnh cho gia sỳc núi chung và cho lợn núi riờng. Cỏc ủặc tớnh nuụi cấy và sinh hoỏ của vi khuẩn Salmonella phõn lập ủược cũng phự hợp với cỏc ủặc tớnh của Salmonella ủó ủược mụ tả trong cỏc tài liệu kinh ủiển (Nguyễn Vĩnh Phước và cộng sự, 1978) [30], (Wilcock B.P. và Schwartz K.J., 1992) [65], (OXID Limitied, 1982) [55] và cỏc tài liệu gần ủõy (Nguyễn Như Thanh, 2001) [39], (Vừ Thị Bớch Thuỷ và cộng sự, 2002) [41].
3.3. Kết quả xỏc ủịnh ủộc lực của một số chủng Salmonella phõn lập
ủược:
Vi khuẩn Salmonella cú rất nhiều serotyp, ủộc lực của mỗi serotyp lại phụ thuộc vào yếu tố gõy bệnh. Ở mỗi serotyp, cỏc yếu tố gõy bệnh quyết ủịnh thể bệnh cấp tớnh hoặc món tớnh, ngoài khả năng gõy bệnh ở lợn chỳng cũn cú khả năng gõy bệnh ở nhiều loài ủộng vật cảm nhiễm mỏu núng, mỏu lạnh khỏc. Song vai trũ gõy bệnh của một số chủng nào ủú chỉ ủược cụng nhận sau khi tiến hành thử ủộc lực (Selbitz H-J. và cộng sự, 1995 [60]).
Trong số cỏc chủng Salmonella phõn lập ủược từ bệnh phẩm, chỳng tụi chọn 22 chủng Salmonella ủể thử ủộc lực qua tiờm truyền chuột nhắt trắng. Cỏc chủng ủược lựa chọn nuụi cấy trong mụi trường nước thịt 370C trong 24h, mỗi chủng tiờm 2 chuột, mỗi chuột tiờm 0,2ml canh trựng theo ủường tiờm phỳc xoang với nồng ủộ 109CFU/ml, theo dừi chuột chết. Sau khi chuột chết
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ67
mổ khỏm lấy mỏu tim nuụi cấy vào mụi truờng nước thịt, thạch mỏu, thạch DHL. Kết quả trỡnh bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Kết quả xỏc ủịnh ủộc lực Salmonella phõn lập ủược bằng phương phỏp tiờm truyền qua chuột nhắt trắng
STT Mẫu Nmơi gửi ẫu Liều tiờm (ml) đường tiờm Số chuột tiờm (con) Số chuột chết (con) Tỷ lệ (%) Thời gian chết (h) Vi khuẩn tỡm thấy ở chuột 1 Gan 2 Ba Vỡ 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 2 Lỏch 1 Ba Vỡ 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 3 Lỏch 2 Ba Vỡ 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 4 Lỏch 3 Ba Vỡ 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 5 Gan Chương Mỹ 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 6 Gan 1 Chương Mỹ 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 7 Lỏch Chương Mỹ 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 8 Phõn 2 Thạch Thất 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 9 Lỏch 1 Thạch Thất 0,2 P.xoang 2 2 100 <8 + 10 Ruột Thạch Thất 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 11 H.lỏch 2 Thường Tớn 0,2 P.xoang 2 2 100 <8 + 12 Phõn 3 Thường Tớn 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 13 Phõn Thường Tớn 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 14 Gan 1 Phỳ Xuyờn 0,2 P.xoang 2 2 100 8-24 + 15 Lỏch1 Phỳ Xuyờn 0,2 P.xoang 2 2 100 12- 18 + 16 Lỏch 2 Phỳ Xuyờn 0,2 P.xoang 2 2 100 12- 18 + 17 Gan 2 Phỳ Xuyờn 0,2 P.xoang 2 2 100 12- 18 + 18 Ruột 2 Phỳ Xuyờn 0,2 P.xoang 2 2 100 12- 18 + 19 Lỏch2 Phỳ Xuyờn 0,2 P.xoang 2 2 100 12- 18 + 20 Gan 5 Phỳc Thọ 0,2 P.xoang 2 2 100 24- 36 + 21 Lỏch 4 Phỳc Thọ 0,2 P.xoang 2 2 100 12- 18 + 22 Phổi 5 Phỳc Thọ 0,2 P.xoang 2 2 100 18- 24 +
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ68
Qua bảng 3.5 chỳng tụi thấy hầu hết cỏc chủng Salmonella giết chết
chuột trong vũng 24 giờ, chỉ một chủng gõy chết chuột sau 24 giờ, ủặc biệt cú 2 chủng giết chết chuột trong vũng 8 giờ. điều này chứng tỏ ủộc lực của cỏc chủng Salmonella phõn lập ủược rất mạnh ủối với chuột nhắt trắng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Những chuột chết ủều ủược mổ khỏm lấy mỏu tim phõn lập lại trờn mụi trường ủặc hiệu của Salmonella thỡ ủều tỡm thấy vi khuẩn.
Kết quả nghiờn cứu này cũng phự hợp với kết quả của cỏc tỏc giả Nguyễn Bỏ Hiờn (2001) [16], đỗ Trung Cứ và cộng sự (2001) [5] .
3.4. Kết quả thử ủộ mẫn cảm với khỏng sinh, hoỏ dược của cỏc chủng
Salmonella phõn lập ủược.
Kể từ khi phỏt hiện ra Sulfamid và chất khỏng sinh, cỏc bệnh truyền nhiễm ở người và gia sỳc ủó bị ủẩy lựị Khụng những vậy, người ta cũn sử dụng chất khỏng sinh như một chất kớch thớch sinh trưởng ở gia sỳc và gia cầm ủể tăng năng suất chăn nuụị
Với sự tiến bộ mạnh mẽ của khoa học sinh học, hàng loạt cỏc khỏng sinh ủó ủược phỏt hiện và sản xuất theo con ủường sinh học và con ủường tổng hợp hoỏ học. Cỏc khỏng sinh ủó và ủang ủược sử dụng một cỏch rộng rói trong y học núi chung và trong thỳ y học núi riờng. Tuy nhiờn hiện nay do việc sử dụng rộng rói khỏng sinh ủể ủiều trị bệnh, trong một số trường hợp ở vi khuẩn gõy bệnh xuất hiện cỏc chủng khỏng thuốc. điều này ủó ủược nghiờn cứu và khẳng ủịnh ở cỏc vi khuẩn ủường ruột, ủặc biệt là Ẹcoli và Salmonella- trớch theo Nguyễn Bỏ Hiờn (2001) [16]. Chớnh vỡ vậy , ủể ủiều
trị một bệnh nhiễm khuẩn nào ủú cú hiệu quả, việc phõn lập mầm bệnh rồi tiến hành kỹ thuật khỏng sinh ủồ ủể xỏc ủịnh loại khỏng sinh cú hiệu lực với chớnh tỏc nhõn gõy bệnh là việc làm cần thiết.
Nghiờn cứu này của chỳng tụi nhằm thăm dũ khả năng mẫn cảm của cỏc chủng Salmonella phõn lập ủược từ cỏc mẫu bệnh phẩm và phõn, nhằm
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ69
xỏc ủịnh loại khỏng sinh cú tỏc dụng mạnh với chỳng ủể ỏp dụng trong ủiều trị bệnh Phó th-ơng hàn lợn.
Trong nghiờn cứu này chỳng tụi chọn 22 chủng vi khuẩn Salmonella ủể thử ủộ mẫn cảm với 14 loại khỏng sinh và hoỏ dược thụng dụng, tiến hành kiểm tra theo phương phỏp kỹ thuật khoanh giấy khỏng sinh khuyếch tỏn. Cỏc mẫu giấy khỏng sinh do hóng OXOID sản xuất. Kết quả trỡnh bày ở bảng 3.6:
Bảng 3.6: Kết quả thửủộ mẫn cảm với khỏng sinh của cỏc chủng Salmonella phõn lập ủược Mức khỏng thuốc đề khỏng Trung gian Nhạy cảm STT Tờn khỏng sinh Số chủng thử n (%) n (%) n (%) 1 Amocylin 22 17 77,27 5 22,73 - - 2 Cefazolin 22 18 81,82 4 18,18 - - 3 Cefuroxime 22 8 36,36 6 27,27 8 36,36 4 Ofloxacin 22 2 9,09 4 18,18 16 72,72 5 Clindamycin 22 20 90,91 2 9,09 - - 6 Lincomycin 22 20 90,91 2 9,09 - - 7 Norfloxacin 22 - - 2 9,09 20 90,91 8 Rifampicin 22 16 72,73 6 27,27 - - 9 Gentamycin 22 18 81,82 4 18,18 - - 10 Ceftriaxone 22 2 9,09 9 40,91 11 50,00 11 Spectinomycin 22 14 63,64 4 18,18 4 18,18 12 Tetracyclin 22 20 90,91 - - 2 9,09 13 Cefalotin 22 13 59,09 5 22,73 4 18,18 14 Ciprofloxacin 22 - - 3 13,64 19 86,36
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ70
Qua bảng 3.6 cho thấy 22 chủng Salmonella phõn lập ủược thử 14 loại khỏng sinh thỡ chỉ cú 20/22 chủng nhạy cảm với Norfloxacin (chiếm 90,09%), 19/22 chủng nhạy cảm với Ciprofloxacin (chiếm 86,36%), 16/22 chủng nhạy cảm với Ofloxacin (chiếm 72,72%), khụng cú chủng nào khỏng lại