2.4.1. Ph−ơng pháp điều tra bệnh HXVK trên đồng ruộng
Sử dụng ph−ơng pháp điều tra của Viện Bảo vệ thực vật 1997 và Cục Bảo vệ Thực vật ban hành năm 1987 và năm 1997, có sự tham khảo quy trình điều tra đánh giá, ph−ơng pháp phân lập và nuôi cấy theo ph−ơng pháp của Trung tâm AVRDC - Wang, J.F. 1998b, 2000 [176], [178]).
Điều tra tình hình bệnh hại cà chua ở một số tỉnh Vùng ĐBSH theo nguyên tắc: mỗi tỉnh chọn 1 - 2 huyện, mỗi huyện chọn 2 xã, mỗi xã chọn vùng sản xuất đại diện, chọn tối thiểu 3 ruộng có đặc tr−ng các vùng đất vàn, cao; vùng đất trũng ; đất cát pha,..có tính đại diện cho vùng, ghi chép các số liệu liên quan đến giống, chế độ luân canh (cây trồng các vụ tr−ớc), thời vụ, địa hình đất đai, chế độ bón phân và chăm sóc t−ới,...
Tại vùng sản xuất màu, trên ruộng cà chua, việc điều tra đ−ợc thực hiện theo ph−ơng pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 50 - 70 cây, các điểm đ−ợc chọn ngẫu nhiên. Dựa trên các triệu chứng điển hình cùng với một số ph−ơng pháp
100 (%)= ì
B A TLB
xác định nhanh trên đồng ruộng để tính số cây bị nhiễm bệnh HXVK trong tổng số cây điều tra, sau đó tính tỷ lệ bệnh theo công thức:
Trong đó: TLB (%) : Tỷ lệ bệnh tính bằng % A: tổng số cây bị nhiễm bệnh HXVK B: tổng số cây điều tra
Điều tra tình hình xuất hiện, diễn biến bệnh HXVK hại cà chua trên tập đoàn các dòng, giống cà chua trồng khảo nghiệm cũng theo ph−ơng pháp 5 điểm chéo góc, định kỳ 7 - 10 ngày một lần, chọn điểm ngẫu nhiên hoặc cố định điểm điều tra, mỗi điểm khoảng 50 - 70 cây. Tính số cây bị nhiễm bệnh và tổng số cây nhiễm sau đó tính tỷ lệ nhiễm bệnh theo công thức trên.
Thời gian điều tra ở ngoài đồng ruộng đ−ợc bắt đầu kể từ khi cây cà chua hồi xanh (sau trồng khoảng 2 tuần) cho đến khi kết thúc thu hoạch với sự l−u ý đặc biệt đến giai đoạn tr−ớc ra hoa đầu, ra quả non cho tới ra hoa và quả non lứa thứ hai là giai đoạn mẫn cảm nhất của cây cà chua. ở v−ờn tập đoàn việc điều tra cũng đ−ợc tiến hành từ khi cấy chuyển ra ruộng cho đến khi kết thúc thu hoạch với sự l−u ý nh− trên.
2.4.2. Ph−ơng pháp lây bệnh nhân tạo, đánh giá tính kháng bệnh của một số giống cà chua và cây làm gốc ghép
Sử dụng ph−ơng pháp lây nhiễm nhân tạo bằng ph−ơng pháp sát th−ơng rễ (Hanson, 1996 [81]; (Wang, 1998) [178]. Cây con 3 tuần tuổi (4 - 5 lá thật) đ−ợc sát th−ơng rễ bằng cách cắt 1- 2 cm quanh gốc, cấy vào túi bầu (kích th−ớc 20 ¯15 cm) có ruột bầu đã đ−ợc xử lý sạch mầm bệnh, sau đó t−ới vào gốc 30 ml dịch vi khuẩn có nồng độ 108 CFU/ml. Bầu cây đặt vào nhà l−ới ở điều kiện luôn giữ ẩm khoảng 100% và nhiệt độ từ 25 - 350. Các chăm sóc khác nh− với quy trình chăm sóc cà chua.
Số cây héo do bệnh HXVK đ−ợc theo dõi 7- 10 ngày một lần và theo dõi trong 4 - 6 tuần. Thống kê tổng số cây bị chết héo do R. solanacearum trên tổng
số cây thí nghiệm. Tính tỷ lệ bệnh (%) theo công thức trên. Trên cơ sở tỷ lệ bệnh, tiến hành phân loại mức kháng hoặc nhiễm theo Tan, (1995) [8] nh− sau:
+ Kháng cao (HR): > 90% cây sống sót (hay số cây chết <10%) + Kháng (R): 70 - 90% cây sống sót (hay số cây chết = 11 - 30%) + Nhiễm trung bình (MS): 50 - 70% cây sống sót (hay chết 31 - 50%) + Nhiễm nặng (HS): 10 - 49% cây sống sót (hay chết = 51 - 90%)
2.4.3 Ph−ơng pháp thu mẫu, phân lập vi khuẩn từ mô cây nhiễm bệnh
Các mẫu có triệu chứng bệnh HXVK điển hình trên đồng ruộng sau khi thu, cắt đoạn gốc thân nhiễm bệnh thấy có mô dẫn có màu thâm đen, khi nhúng vào cốc n−ớc sạch thì có dòng dịch vi khuẩn màu trắng sữa chảy ra. Một số triệu chứng khác có thể giúp nhận dạng nhanh nh− cây chuyển héo nhanh, toàn thân hay một phần, hoặc nếu cây bị nhiễm bệnh HXVK ở giai đoạn muộn có triệu trứng ra rễ phụ và ở gần gốc có những nốt s−ng, ta tiến hành thu đoạn thân gần gốc có chiều dài khoảng 3 đến 5 cm, cho vào túi sạch, ghi nhãn với các thông tin về nơi thu mẫu, ngày tháng, giống, cây trồng vụ tr−ớc, v.v.
Các mẫu sau khi thu về đ−ợc rửa sạch, sát trùng bằng cồn 70% rồi dùng dao vô trùng bổ dọc đoạn thân cây (mẫu) và cắt lấy những phần thân có màu nâu nhạt đem ngâm trong ống chứa n−ớc cất vô trùng. Sau một khoảng thời gian nhất định ta sẽ thấy trên mạch dẫn của đầu cắt tiết ra giọt dịch và dòng dịch vi khuẩn màu trắng sữa chảy ra. Sau khoảng 20 phút để ở nhiệt độ phòng, bỏ đoạn mẫu ra khỏi ống. Các ống dịch vi khuẩn này đ−ợc bảo quản ở 25oC để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Ph−ơng pháp phân lập truyền thống đ−ợc dùng dựa trên việc sử dụng môi tr−ờng TZC để nhận dạng các dòng vi khuẩn thông qua hình dạng và màu sắc khuẩn lạc khi phát triển trên môi tr−ờng này. Chi tiết của ph−ơng pháp này đ−ợc miêu tả trong các công trình của Kelman et al. (1954) [106]. Pha loãng dịch vi khuẩn trong ống với dung dịch đệm hoà loãng để đạt nồng độ thích hợp sao cho
có thể thu đ−ợc các khuẩn lạc riêng biệt sau khi cấy gạt trên môi tr−ờng TZC. Để hộp lồng trong tủ định ôn, ở nhiệt độ 30oC, theo dõi kết quả sau 24, 48, 72 giờ. Từ mỗi nhóm hình thái khuẩn lạc, tiến hành chọn từ 3 - 5 khuẩn lạc để cấy vạch trên môi tr−ờng. Sau 24 - 48 giờ giữ ở nhiệt độ 300C, tiến hành chọn những khuẩn lạc màu sữa trắng, tâm phớt hồng có kiểu hình thái, màu sắc điển hình của loài vi khuẩn gây bệnh HXVK có độc tính để giữ trong n−ớc vô trùng hoặc trong n−ớc cất (nếu cần bảo quản lâu hơn) để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.4.4 Ph−ơng pháp nhận dạng và phát hiện nhanh R.
solanacearum bằng kỹ thuật PCR và dùng enzym cắt hạn chế
Hoá chất đã đ−ợc đề tài sử dụng:
+ Đệm TNE (Tris sodium chlorid EDTA) pH=8 + Dung dịch SDS 20% (Sodium dodelcyl sulphate) + Chloroform/isoamylalcohol (24/1 - tỷ lệ về thể tích) + Phenol bão hoà n−ớc
+ Ethanol 96% và Ethanol 70% + Dung dịch đệm TE
Dịch vi khuẩn R. solanacearum đ−ợc chiết ra từ cây cà chua bị bệnh héo xanh bằng ph−ơng pháp giọt dịch lấy từ đoạn cắt mẫu.
Quy trình chiết DNA của vi khuẩn R. solanacearum từ dịch chiết thô của cây bệnh:
+ Hoà tan dịch vi khuẩn (khoảng bằng đầu que diêm) vào trong 500 àl đệm TNE. Sau đó cho tiếp 100 àl SDS 20% và 350 àl phenol bão hoà, lắc mạnh rồi để 30 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Cho tiếp 25 àl chloroform/isoamylalcohol, lắc và li tâm 10 phút.
+ Sau khi li tâm, dung dịch phân thành lớp, dùng micropipet lấy 450 àl dung dịch ở phần trên chuyển sang tube mới.
n−ớc đá hoặc trong tủ đá 10 phút, sau đó ly tâm 10 phút, loại bỏ dung dịch, giữ lấy cặn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Dùng cồn 700 rửa 2 lần, để khô trong không khí. + Hoà cặn vào 20 àl đệm TE và lấy 0,1 àl để chạy PCR.
• Quy trình chiết DNA từ đất cũng t−ơng tự nh− chiết DNA từ dịch chiết thô nh−ng chỉ khác là lấy 2 gr đất ở vùng rễ cây bị bệnh cho vào 20 ml n−ớc cất ly tâm nhẹ để thu đ−ợc dịch vi khuẩn.
* Thành phần phản ứng gồm có: PCR buffer x 10 (2,5 àl); DNA temp (0,5 àl); MgCl2 (1,5 àl); dNTPs (0,5 àl); Red hot (0,125 àl); DIV1F (0,5 àl); DIV1R (0,5 àl) và thêm n−ớc vô trùng để dung tích cuối cùng là 25 àl.
* Trình tự của 2 đoạn mồi DIV1F và DIV1R: Đoạn mồi Trình tự (5 - 3) Vị trí gắn (16 S, DNA) DIV1F : CGCACTGGTTAATACCTGGTG 455 - 475 DIV1R : CTACCGTCGTAATCGCCCTCC 1454 - 1474
* Ch−ơng trình chạy PCR: phản ứng đ−ợc đặt vào máy điều hoà nhiệt tuần hoàn (Icycler, bio-Rad) với chu kỳ nhiệt nh− sau:
940 C trong 5 phút x 1 vòng
500 C trong 1 phút x 35 chu trình 720 C trong 1 phút
940 C trong 1 phút
Và 720 trong 10 phút sau khi kết thúc 35 chu trình * Chạy điện di:
Lấy sản phẩm chạy PCR đem chạy điện di trên gel agarose trong điện TAE 1% với điện thế 100V trong thời gian 30 phút. Sau khi chạy song đem nhuộm trong dung dịch Ethidium bromide và quan sát d−ới tia tử ngoại. Chụp ảnh bằng phim polaroid.
* Cắt sản phẩm PCR bằng enzym cắt hạn chế:
- Enzym sử dụng: Hpa II và Rsa 1 là các endonucleasa của hãng Promega. - Quy trình:
Hpa II: thành phần phản ứng: 15 àl sản phẩm PCR
2 àl đệm phản ứng (đệm A) 1 àl BSA đã đ−ợc Acetyl hoá 2 àl enzym Hpa II
+ Rsa I: T−ơng tự chỉ khác đệm C và enzym Rsa I + Tube đ−ợc ủ ở 370C (bể nhiệt) trong 2 giờ
+ Phân tích sản phẩm cắt giới hạn bằng Agarose 2% trong TAE ở điều kiện 100V/45 phút. Quan sát d−ới tia cực tím chụp ảnh Polaroid.
2.4.5. Ph−ơng pháp thử thuốc hoá học trong phòng đối với R.
solanacearum trên môi tr−ờng nhân tạo
Pha chế môi tr−ờng PSA cùng với thuốc Batocide 12 WP và Exine 4,5 HP ở các nồng độ 0,05%; 0,10 %; 0,20% trong các hộp petri. Vi khuẩn đ−ợc phân lập, hoà loãng ở mức 10-3. Cấy vi khuẩn vào các đĩa petri với l−ợng dung dịch vi khuẩn 1àl khi môi tr−ờng còn lỏng và ở 500C.
Chuyển vào tủ định ôn ở nhiệt độ 280C, sau đó tiến hành đếm số l−ợng khuẩn lạc 48, 72 và 96 giờ sau nuôi cấy.
So sánh hiệu lực của thuốc theo công thức của Abbott: 100 A B A HL(%)= − ì Trong đó:
B: số l−ợng khuẩn lạc ở công thức thí nghiệm Công thức thí nghiệm: 7 với 3 lần nhắc lại:
- Công thức 1: Đ/C không xử lý
- Công thức 2: môi tr−ờng PPSA - Batocide 12 WP 0,05 % - Công thức 3 : môi tr−ờng PPSA - Batocide 12 WP 0,10 % - Công thức 4: môi tr−ờng PPSA - Batocide 12 WP 0,20 % - Công thức 5: môi tr−ờng PPSA - Exin 4 HP 0,05%
- Công thức 6: môi tr−ờng PPSA - Exin 4 HP 0,10 % - Công thức 7: môi tr−ờng PPSA - Exin 4 HP 0,20 %
2.4.6. Thí nghiệm đánh giá so sánh, và tuyển chọn giống cà chua kháng bệnh héo xanh vi khuẩn
Thí nghiệm đ−ợc tiến hành ở vụ đông xuân 2000, vụ xuân hè 2001 và vụ đông xuân 2001- 2002, tại khu thí nghiệm của bộ môn Rau - Gia vị, Viện Nghiên cứu rau quả - Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội. Thí nghiệm đ−ợc bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 4 lần nhắc lại, áp dụng quy trình kỹ thuật trồng cà chua đ−ợc ban hành của Cục Khuyến nông, Khuyến lâm có sự kết hợp quy trình của Trung tâm AVRDC.
Vụ đông xuân 2000 - 2001 gieo ngày 31/8/2000, trồng ngày 25/9/2000. Vụ xuân hè gieo ngày 12 /2/2001, trồng ngày 17/3/2001.
Vụ đông xuân 2001 - 2002 gieo ngày 15/8/2001, trồng ngày 15/9/ 2001.
2.4.7. Thí nghiệm khảo nghiệm diện rộng của hai dòng cà chua có triển vọng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các giống đ−ợc chọn lọc từ các nghiên cứu khảo nghiệm quy mô nhỏ ban đầu CLN1462A (cà chua ăn t−ơi) và PT4719A (cà chua chế biến) đ−ợc trồng tại thôn Hoà Đình, xã Võ C−ờng, Thị xã Bắc Ninh và tại hợp tác xã Đặng Xá - Gia
Lâm - Hà Nội vụ xuân hè 2002, trồng ngày 7/ 2/ 2002.
Cây cà chua đ−ợc gieo tại v−ờn −ơm, sau đó trồng trên vùng đất năm tr−ớc đã bị nhiễm bệnh HXVK nặng. Các thông số kỹ thuật nh− l−ợng phân bón, mật độ trồng, chế độ chăm sóc, t−ới n−ớc và xới xáo đất đ−ợc thực hiện nh− quy trình đối với cà chua trồng khảo nghiệm, có l−u ý đến điều kiện chăm sóc của ng−ời dân. Các chỉ tiêu cần thu thập, đánh giá: tỷ lệ cây sống và chết héo do bệnh HXVK sau lây nhiễm 1, 2, 3, 4 tuần, các chỉ tiêu sinh tr−ởng, phát triển, tình hình nhiễm sâu bệnh hại, các yếu tố cấu thành năng suất, năng suất và đặc điểm hình thái, chất l−ợng quả đ−ợc theo dõi và thu thập.
2.4.8. Thí nghiệm nghiên cứu xác định gốc ghép phù hợp
Đ−ợc tiến hành với 3 loại gốc ghép khác nhau:
Cà tím (giống Pingtunglong - giống thuần của Thái Lan) Cà pháo (giống địa ph−ơng)
Cà bát (giống địa ph−ơng)
Giống cà chua làm ngọn ghép: VL 2000, VL 2200
Thời gian thí nghiệm: Từ tháng 7/1999 đến tháng 12/1999 Đối chứng là cà chua không ghép.
Thí nghiệm khi trồng ra ruộng thí nghiệm đ−ợc bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 3 lần nhắc lại.
Các công thức thí nghiệm:
Công thức 1. Cà chua ghép lên cà tím Công thức 2. Cà chua ghép lên cà pháo Công thức 3. Cà chua ghép lên cà bát
2.4.9. Thí nghiệm nghiên cứu khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của một số giống cà tím làm gốc ghép và một số giống cà chua làm ngọn ghép
Các giống tham gia thí nghiệm: Cà tím: Pingtunglong
EG203 (giống cà tím nhập nội từ Trung tâm AVRDC) EG219 (giống cà tím nhập nội từ Trung tâm AVRDC)
EG192 (giống cà tím nhập nội từ Trung tâm AVRDC) EG195 (giống cà tím nhập nội từ Trung tâm AVRDC) Cà chua: VL2000 (giống nhập nội, đã trồng phổ biến trong sản xuất) VL2200 (giống nhập nội, đã trồng phổ biến trong sản xuất)
Ba Lan
VR2 (giống mới đ−ợc công nhận) L390 ( giống nhiễm chuẩn nhập từ Trung tâm AVRDC) Thí nghiệm đ−ợc tiến hành trong nhà l−ới của Viện nghiên cứu Rau quả. Ph−ơng pháp bố trí thí nghiệm và các b−ớc trồng và chăm sóc theo h−ớng dẫn của quy trình trồng và chăm sóc cây cà chua và h−ớng dẫn bố trí thí nghiệm của Trung tâm AVRDC. Cây con đ−ợc nhiễm qua lá và rễ ở giai đoạn 5 - 6 lá thật sau đó trồng vào túi bầu có kích th−ớc 10¯12 cm. Thí nghiệm đ−ợc bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh với 4 lần nhắc lại. Mỗi công thức tiến hành với 20 cây.
Nguồn vi khuẩn héo xanh đ−ợc sử dụng từ nguồn đã phân lập và thử nghiệm có tính độc từ Võ C−ờng - Bắc Ninh, An Hải, Hải Phòng, Nam Hồng, Hà Nội (dòng vi khuẩn ký hiệu BN1, AH, HP, HN...) để lây nhiễm nhân tạo các giống để xác định mức kháng HXVK phù hợp làm gốc ghép.
2.4.10 Ph−ơng pháp ghép
Sử dụng ph−ơng pháp ghép nối ngọn.
Vật liệu dùng để giữ gốc ghép và ngọn ghép là ống cao su có đ−ờng kính 2-3 mm. Hạt cà tím đ−ợc gieo tr−ớc hạt cà chua từ 7-10 ngày. Khi cây cà chua và cây cà tím có 3 - 4 lá thật thì tiến hành ghép.
Cây cà chua sau khi ghép đ−ợc đặt ở nơi có ánh sáng tán xạ, d−ới sự chăm sóc th−ờng xuyên và luôn luôn giữ độ ẩm 80 - 100%. Khi cây hồi xanh, cho cây thích nghi dần với ánh sáng tự nhiên khoảng một tuần tr−ớc khi đem trồng ra ruộng sản xuất.
Quy trình trồng trọt, ph−ơng pháp cắm giàn tỉa nhánh và chăm sóc đ−ợc tiến hành nh− đối với cà chua trồng trong sản xuất.
2.4.11. Các mô hình trình diễn cà chua ghép tại các hợp tác x∙
Các chỉ tiêu theo dõi:
− Thời gian từ gieo đến mọc (ngày). − Thời gian từ mọc đến ghép đ−ợc (ngày).
− Tình hình sâu bệnh hại nói chung và tỷ lệ bệnh HXVK trên mô hình nói riêng.
− Các chỉ tiêu của cà chua và cà khi đ−ợc ghép.
− Thời gian qua các giai đoạn sinh tr−ởng phát triển của cây cà chua ghép sau khi trồng ra đồng (ngày). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
− Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất (tấn/ha).
− Một số chỉ tiêu về số l−ợng và chất l−ợng quả của cà chua ghép và không ghép. − Sơ bộ đánh giá hiệu quả kinh tế của cà chua ghép.
2.4.12. Ph−ơng pháp thí nghiệm khảo sát hiệu lực thuốc phòng trừ vi khuẩn trên đồng ruộng
giống cà chua VL 2000, tổng diện tích 1 sào (360 m2), gồm 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, diện tích mỗi ô 25 m2, xung quanh có vành đai bảo vệ.
+ Công thức 1: đối chứng phun n−ớc lã.
+ Công thức 2: Batocide 12 WP, phun ở nồng độ 0,2%.
+ Công thức 3: Exin 4,5 HP (Phytoxin VS), phun ở nồng độ: 0,2 %.
Tr−ớc khi phun thuốc 1 ngày và sau khi sử lý 7 - 10 ngày, khu ruộng thí nghiệm cần đ−ợc kiểm tra, đếm toàn bộ số cây bị bệnh và tổng số cây. Thời gian theo dõi thí nghiệm 7 - 10 ngày/ lần kể từ khi phun thuốc cho tới khi thu hoạch. Số liệu thu thập đ−ợc xử lý và tính hiệu lực của thuốc theo công thức của Abbott và Henderson - Tilton: 100 Ca Tb Cb Ta