e. Tetracycline là nhóm kháng sinh phổ tương ñố ig ần nhau do Streptomyces spp sinh ra.
3.1.ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở Vườn Quốc gia Cát Bà
Việt Nam với hơn 1.700 km bờ biển trải từ bắc xuống nam với rất nhiều ựảo có mức ựa dạng sinh học cao. Một sốựảo của Việt Nam ựã ựược công nhận là vườn quốc gia ựể bảo tồn và phát triển bền vững nguồn gene sinh học. Trong khi hệ thực vật và ựộng vật ở các vườn quốc gia của Việt Nam ựã ựược quan tâm nghiên cứu về mức ựộựa dạng rất nhiều thì vi sinh vật chưa ựược quan tâm ựúng mức cho dù vi sinh vật ựóng vai trò chủ ựạo trong sự phát triển của công nghệ sinh học. Hiện vẫn còn ắt các nghiên cứu liên quan ựến sựựa dạng cũng như khả năng ứng dụng của hệ vi sinh vật ở các vườn quốc gia này.
Trong số các ựảo của Việt Nam, Cát Bà là ựảo lớn nhất của Vịnh Hạ Long, di sản thiên nhiên thế giới. đảo hiện có 620 loài thực vật bậc cao, 32 loài ựộng vật có vú, 69 loài chim và 20 loài bò sát. Cũng tương tự như hầu hết các khu bảo tồn ở Việt Nam, Vườn quốc gia Cát Bà chưa ựược nghiên cứu về mức ựộ ựa dạng và tiềm năng sử dụng của vi sinh vật.
Nhằm góp phần nghiên cứu về nhóm xạ khuẩn có ởựảo Cát Bà, ựề tài ựã tiến hành phân lập xạ khuẩn theo hai phương pháp khác nhau như ựã mô ở chương II. Qua ựó ựã phân lập ựược 424 chủng xạ khuẩn từ các mẫu ựất và lá cây mục thu tại Cát Bà. Trong số 424 chủng ựó, 353 chủng (83.25%) phân lập ựược từ ựất và 71 chủng (16.75%) từ mẫu lá cây mục.
Tiếp theo, các chủng xạ khuẩn phân lập ựược ựã ựược phân loại theo hình thái ựể
phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn hiếm) (Bảng 3.1). để ựịnh loại chắnh xác hơn nhóm xạ khuẩn hiếm phương pháp ựọc trình tự một phần rDNA 16S (khoảng 900 bp) ựã ựược thực hiện và so sánh với các trình tự ựã có trên cơ sở dự liệu bằng công cụ Blast Search.
Qua bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy 296 chủng phân lập ựược là Streptomyces (chiếm khoảng 69,81%) và 128 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) (chiếm khoảng 30,19%). Các nghiên cứu trước ựây cho thấy Streptomyces là một trong những nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong ựất và phân bổ rộng rãi trên thế giới (Hopwood A. D., 2007). Do vậy tỷ lệ cao của Streptomyces trong bộ sưu tập xạ khuẩn ở Cát Bà khẳng ựịnh kết luận này.
Nhìn chung, hầu hết các chủng Streptomyces phân lập ựược mọc nhanh và khỏe, xuất hiện trước tiên trong các ựĩa phân lập và dễ phân lập. Ngược lại, các chủng xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) mọc chậm, khuẩn lạc nhỏ, khó phân lập và nuôi cấy. Số lượng
xạ khuẩn hiếm thu ựược từ phương pháp ly tâm-hoàn ẩm nhiều hơn bằng phương pháp sấy khô truyền thống.
Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ựược
Các nhóm xạ khuẩn Số lượng chủng %
Streptomyces 296 69.81
Xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces)
Micromonospora 27 6.36 Nonomuraea 17 4.00 Nocardia 12 2.83 Kineosporia 8 1.90 Microbispora 7 1.65 Actinomadura 7 1.65 Pseudonocardia 6 1.42 Nocardiopsis 6 1.42 Micrococcus 5 1.18 Streptosporangium 5 1.18 Khác (mỗi loại ắt hơn 1%) 28 6.60 Tổng cộng 424 100.00
Xét về mức ựộựa dạng, chúng tôi nhận thấy các chi Micromonospora, Nonomureae và Nocardia là các chi chiếm ưu thế trong các chi xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) thu
thập tại Cát Bà (Bảng 3.1). Các loài thuộc ba chi này cũng thường ựược phân lập ở các ựịa ựiểm khác ở Việt Nam (Duong V.H., Ando K., 2010).
Các chủng phân lập ựược hiện ựược lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (Vietnam Type Culture Collection, VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học trong glycerol 20% ở −80 ồC.
3.2 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh
để sàng lọc các chủng sinh kháng sinh, 4 chủng vi sinh vật ựại diện cho vi khuẩn Gram âm và dương; nấm và nấm men ựã ựược lựa chọn làm vi sinh vật kiểm ựịnh.
Bước sàng lọc ựầu tiên ựược thực hiện bằng phương pháp mảnh thạch như ựã mô tả ở chương II. Qua ựó cho thấy trong 424 chủng xạ khuẩn nghiên cứu chỉ có 115 chủng
(chiếm khoảng 27,12%) cho hoạt tắnh ựáng kể kháng ắt nhất một trong bốn vi sinh vật kiểm ựịnh.
Tiếp theo 115 chủng này ựược dùng làm ựắch cho bước sàng lọc thứ hai sử dụng phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy. Một số hình ảnh ựại diện cho bước phân tắch này ựược trình bày ở hình 3.1. Từ bước sàng lọc này 17 chủng thể hiện hoạt tắnh tương ựối cao với ắt nhất hai trong bốn vi sinh vật kiểm ựịnh ựã ựược lựa chọn. Hoạt tắnh tương ựối của các chủng này ựược trình bày ở bảng 3.2.
Hình 3.1. đánh giá hoạt tắnh kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn
Một số hình ảnh tiêu biểu minh họa cho phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy. Trong số 17 chủng chọn lọc ựược, 14 chủng có hoạt tắnh kìm hãm vi khuẩn Gram
âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn Gram dương (M. luteus) và 11 chủng có hoạt tắnh kháng cả hai nhóm vi khuẩn. Với các tế bào nhân thật, gồm nấm (F. oxysporium) và
nấm men (C. albicans), 12 chủng có hoạt tắnh kháng nấm và chỉ 6 chủng có hoạt tắnh kháng nấm men (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Hoạt tắnh kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược Hiệu quả ức chế vi sinh vật kiểm ựịnh
(ựường kắnh vòng kìm hãm, mm)
Chủng
E. coli M. luteus F. oxysporium C. albicans
A45 10 0 6 0 A149 8 6 0 0 A154 8 8 0 0 A160 0 6 0 10 A232 6 7 0 12 A390 10 10 18 0 A396 8 12 0 0 A410 24 0 10 0 A427 16 0 12 0
A444 0 7 8 0 A1018 0 40 10 16 A1018 0 40 10 16 A1022 16 30 10 0 A1041 22 28 6 0 A1043 8 32 6 0 A1073 21 30 10 10 A1393 14 18 14 6 A1470 15 26 12 0 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả còn cho thấy 9 trong số 17 chủng chọn lọc ựược có hoạt tắnh mạnh với cả vi khuẩn và nấm (ựường kắnh vòng kìm hãm > 10 mm). đặc biệt là hai chủng A1073 và A1393 kìm hãm cả bốn chủng vi sinh vật kiểm ựịnh (bảng 3.2, các dòng ựược bôi ựậm).