e. Tetracycline là nhóm kháng sinh phổ tương ñố ig ần nhau do Streptomyces spp sinh ra.
2.2.8.Các phương pháp phân loại xạ khuẩn
a. Qua ñặc ñiểm hình thái
Các ñặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn ñược quan sát sau hai tuần nuôi ở các ñiều kiện như ñã mô tả. Các ñặc ñiểm hiển vi như hệ sợi cơ chất, hình thái sợi khí sinh, cấu trúc chuỗi bào tử ñược quan sát dưới kính hiển vi phản pha (Carl-Zeiss) có nối máy ảnh và phần mềm chụp ảnh. Atlas hình thái xạ khuẩn (Gernot, 1997) và Sổ tay nhận dạng xạ khuẩn (Identification Manual of Actinomycetes) (Miyadoh et al, 2001) ñược dùng ñể
tham khảo vềñặc ñiểm phân loại.
b. Bằng sinh học phân tử Tách chiết DNA
DNA genome của các chủng xạ khuẩn ñược tách chiết theo phương pháp ñã ñược Marmur (1961) và Saito (1963) mô tả với một số cải tiến. Cụ thể là, nuôi xạ khuẩn trong môi trường YS lỏng trong 3 ngày ở 30°C và thu tế bào bằng ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút. Tế bào sau khi ñã ñồng nhất (bằng que nhựa vô trùng, rửa bằng 2 ml ñệm 1TE 2 – 3 lần và hòa tan lại trong 0.5 ml EDTA 5 mM, pH 8) bị phá vỡ bằng xử lý với lysozyme (50 µl có nồng ñộ 40 mg.ml−1) ở 37°C qua ñêm, rồi ñược xử lý với SDS (50 µl có nồng ñộ 20%) và proteinase K (50 µl có nồng ñộ 4 mg.ml−1) ở 55°C trong 1 giờ. DNA ñược chiết bằng bổ sung một thể tích tương ñương hỗn hợp phenol:chloroform:isoamine alcohol = 25:24:1 (PCI), trộn và ly tâm ở 15000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. Bước chiết này ñược lặp lại 3 lần. DNA nhiễm sắc thể ñược kết tủa bằng 2 thể tích 2-propanol lạnh, rồi làm khô bằng ethanol 70% ở nhiệt ñộ phòng và hòa tan trong 100 µl nước cất.
Phản ứng PCR, giải trình tự và phân tích cây chủng loại phát sinh Gene rDNA 16S ñược khuếch ñại bằng cặp primer:
27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)
Hỗn hợp phản ứng (50 µl) gồm 5 µl ñệm (0.2 M Tris-HCl pH 8.3, 0.25 M KCl, 20 mM MgCl2), 20 nM mỗi loại deoxynucleotide, 50 pM mỗi loại primer, 2.5 U Taq DNA
polymerase, và 1 µl DNA khuôn (nồng ñộ khoảng 10-20 ng). Chu trình PCR gồm 5 phút sốc nhiệt ở 95°C, tiếp ñến là 30 chu kỳ gồm 95°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, và 72°C trong 1 phút, cuối cùng là 72°C trong 7 phút. Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel agarose, cắt và tinh sạch băng DNA bằng kit QIAquick gel extraction (Qiagen), và ñọc trình tự bằng máy tựñộng ABI 3110 Avant Appied Biosystems sequencer.
Trình tự gen sau ñó ñược phân tích so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan hiện ñã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search. So sánh tương ñồng với các trình tự liên quan ñược thực hiện bằng phần mềm CLUSTAL_X, phiên bản 1.8 (Thompson et. al., 1997). Cây phân loại ñược dựng theo phương pháp neighbour-joining (Saitou, Nei, 1987), trong ñó ñịnh dạng cây ñược tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh ña chiều (Felsenstein, 1985).