đơn vị hoặc bao gồm các nhóm chức năng thuộc các phần dưới đơn vị khác nhau.
4.5. Phương pháp thăm dò và phát hiện các nhóm chức năng trong trungtâm hoạt động của enzyme tâm hoạt động của enzyme
Đây là việc khó khăn và phức tạp, phải sử dụng hàng loạt phương pháp khác nhau. Khi xác định được vai trò quan trọng của một nhóm nào đó đối với hoạt tính enzyme, chưa có nghĩa là nhóm đó thuộc trung tâm hoạt động của enzyme, bởi vì có nhiều nhóm chức năng chỉ làm nhiệm vụ duy trì cấu trúc không gian hoạt động cho phân tử enzyme.
Muốn thăm dò, phát hiện và xác định các nhóm chức năng của phân tử enzyme, người ta thường dùng các phương pháp vật lý, hóa học, xác định hằng số ion hóa của các nhóm chức năng và tốt nhất là kết hợp với việc nghiên cứu cấu trúc phân tử của enzyme và của trung tâm hoạt động.
Các phương pháp vật lý có khả nưng phá huỷ một cách đặc hiệu các nhóm chức năng của enzyme thường không nhiều, vì khó có thể chọn được các tác nhân chỉ phá huỷ một số nhóm hóa học nhất định mà lại không làm ảnh hưởng đến toàn bộ cấu trúc của phân tử enzyme. Chính vì vậy, thông thường người ta khóa, phá huỷ, hoặc đánh dấu các nhóm chức năng đó bằng các thuốc thử hóa học như chất ức chế đặc hiệu, cơ chất hoặc coenzyme .
4.5.1. Phương pháp dùng chất ức chế
Tùy trường hợp có thể dùng các chất ức chế đặc hiệu khác nhau, ví dụ:
- Đối với một số enzyme oxy hóa khử có nhóm hoạt động là ion sắt người ta dùng xyanua (cyanide CN) để phát hiện vai trò của ion sắt đối với hoạt tính của enzyme vì CN kết hợp với ion sắt làm cho enzyme mất khả năng vận chuyển điện tử. Ví dụ CN ức chế enzyme cytochromoxydase.
- Một số enzyme cần có ion kim loại tham gia vào quá trình xúc tác hoặc để giữ ổn định cấu trúc phân tử enzyme. Để thăm dò phát hiện đặc tính cần kim loại của chúng, người ta dùng chất kết hợp kim loại như EDTA (Ethylen diamino tetraacetate) hoặc orthophenantrolin... Nếu là enzyme cần kim loại thì sẽ mất hoạt tính.
- Để thăm dò vai trò nhóm - S - CH3 của methionine đối với hoạt tính của enzyme thì oxy hóa nhóm này thành sunfoxit tương ứng: và enzyme sẽ mất khả năng xúc tác.
- Vai trò của nhóm - SH của Cysteine đối với hoạt động của enzyme được xác định bằng cách cho phản ứng với muối kim loại nặng hoặc dẫn chất của chúng ví dụ PCMB (parachloromercuri - benzoate) hoặc cho phản ứng với iodoacetate.
Dưới tác dụng của các chất đã nêu, nhóm SH của enzyme sẽ bị khóa và enzyme mất hoạt động.
- Để phát hiện nhóm imidazol của Histidine đối với hoạt tính của enzyme người ta phá huỷ nhóm này bằng phương pháp oxy hóa quang học với sự có mặt của xanh metylen hoặc cho phản ứng với iodoacetate. Khi nhóm chức này bị phá huỷ hoặc bị khóa thì enzyme đều mất hoạt tính.
- Để tìm hiểu vai trò của nhóm ε - NH2 của lysine có thể cho phản ứng với fluordinitro benzen (FDNB) để tạo thành dinitrophenyl (DNP) màu vàng. FDNB phản ứng với các nhánh bên của amino acid khác như imidazol, phenol, thiol thì tạo ra dẫn chất DNP không màu.
Cũng có thể ức chế nhóm ε - NH2 bằng cách cho phản ứng với những yếu tố oxy hóa. - Vai trò của nhóm - OH của serine đối với hoạt tính của enzyme được thăm dò bằng cách cho tác dụng với chất ức chế đặc hiệu là diisopropylfluor-phosphate (DFP). DFP sẽ khóa nhóm - OH của serine và enzyme mất hoạt tính.
Trong một số trường hợp các nhóm chức năng tham gia vào cơ chế xúc tác có thể được phát hiện dễ dàng hơn so với các nhóm hóa học khác cùng loại, đó là nhờ khả năng phản ứng đã tăng lên do vị trí đặc biệt của chúng trong phân tử enzyme.
4.5.2. Phương pháp đánh dấu bằng cơ chất đặc hiệu hoặc coenzyme
- Nhiều người cho rằng dùng cơ chất đặc hiệu để đánh dấu các nhóm chức năng là hợp lý nhất song cũng gặp nhiều khó khăn và phức hợp được tạo thành thường không vững bền (phức hợp enzyme - cơ chất dễ dàng bị phân ly ngược chiều, phức hợp enzyme -
nghiệm khôn khéo người ta đã tách được các sản phẩm trung gian của phản ứng kết hợp với enzyme bằng liên kết đồng hóa trị vững bền. Ví dụ như người ta đã tách được phosphoserine đánh dấu trong trường hợp của phosphoglucosemutase ở quá trình phản ứng vận chuyển phosphore, hoặc phức hợp enzyme với sản phẩm trung gian của triosephosphate dehydrogenase.
- Phương pháp đánh dấu bằng coenzyme cũng được sử dụng và có giá trị trong một số trường hợp. Như người ta đã nghiên cứu trung tâm hoạt động của cytochrome C bằng cách dùng coenzyme heme làm chất đánh dấu cũng như dùng pyridoxal phosphate làm chất đánh dấu để nghiên cứu một số enzyme cần coenzyme này làm yếu tố phối hợp.
Cần lưu ý là chỉ có thể dùng coenzyme, cơ chất hay chất giống cơ chất để đánh dấu những nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzyme khi nào liên kết hóa học giữa chất đánh dấu với những nhóm này đủ vững bền hoặc được biến thành những liên kết vững bền bằng phương pháp thích hợp. Mặt khác, khi cơ chất hoặc coenzyme kết hợp với enzyme đã làm cho enzyme không bị ức chế bởi các thuốc thử đặc hiệu có thể do enzyme hoặc cơ chất đã kết hợp với các nhóm chức năng, hoặc cũng có thể làm ngăn cách một cách đặc hiệu giữa các nhóm chức năng của enzyme và thuốc thử. Như vậy, ở các trường hợp đã nêu, các nhóm chức năng đều được kết luận bằng cách suy luận gián tiếp chứ không phải bằng các kết quả thực nghiệm trực tiếp.
4.5.3. Xác định trị số pK của các nhóm hoạt động
Enzyme là một phân tử protein đặc hiệu có nhiều nhóm hóa học có thể bị ion hóa, nên enzyme có thể tồn tại dưới nhiều trạng thái ion hóa khác nhau; nhưng thường chỉ có một dạng ion của phân tử enzyme có khả năng thể hiện hoạt tính xúc tác, trong đó chính trạng thái ion hóa của các nhóm hoạt động của enzyme có liên quan trực tiếp đến quá trình xúc tác.
Trạng thái ion hóa của các nhóm khác không có liên quan trực tiếp đến cơ chế xúc tác của enzyme thường không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.
Trạng thái ion hóa của enzyme, của cơ chất và của phức hợp enzyme-cơ chất chịu ảnh hưởng trực tiếp của pH của môi trường phản ứng. Do đó nghiên cứu ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme có thể tìm được trị số pK của nhóm hoạt động của enzyme (K = hằng số ion hóa, pK = - logK), Với trị số của pK có thể suy đoán các nhóm hoạt động của enzyme.
Cũng cần chú ý rằng, phương pháp xác định trị số pK chỉ là những chỉ dẫn sơ bộ và cần phải phối hợp với nhiều phương pháp khác.
4.5.4. Nghiên cứu cấu trúc phân tử
Các phương pháp hóa học đặc hiệu hoặc xác định trị số pK chỉ là những thông tin cần thiết để suy đoán và chưa đủ để chứng minh về vai trò của các nhóm hoạt động. Vì vậy cần phải nghiên cứu cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt động. Bằng cách cắt bỏ dần các gốc amino acid của phân tử enzyme người ta đã chứng minh hoạt độ enzyme chỉ phụ thuộc vào một số bộ phận nhất định của phân tử enzyme.Ví dụ papain là enzyme thủy phân protein, khi bị cắt bỏ 2/3 số gốc amino acid vẫn còn hoạt động, trung tâm hoạt động nằm ở đầu nhóm - COOH.
4.6. Các dạng phân tử của enzyme