II.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu giống nấm
Nguồn mẫu giống nấm để thực hiện các thí nghiệm của đề tài nhận được từ công ty DONA (11 Vườn Thuốc, Ấp Cây Đa, xã Tân Phú Trung, Huyện Củ Chi, TP. HCM) mẫu đã được nuôi cấy khoảng 2 tuần tuổi. Chọn các ống nghiệm có tơ phát triển tốt, đều và thuần chủng, chưa có hiện tượng lão hóa.
Vỏ cà phê
Vỏ cà phê được thu gom tại các nhà dân trên địa bàn Gia Lai. Sau đó được ngâm vôi, phơi khô để phối trộn với các thành phần khác cho vào túi PP.
Dụng cụ và thiết bị -Tủ cấy đơn giản - Lò hấp khử trùng
- Ống nghiệm, pipep các loại - Bông gòn không thấm - Chai thủy tinh
- Đĩa Petri - Bình tam giác - Cân điện tử - Nồi hấp - Lò hấp, tủ sấy
Hình 8: Tủ cấy đơn giản
Hình 10: Cấu tạo của lò hấp khử trùng
Hình 11: Lò hấp bịch phôi Nguyên vật liệu và hoá chất
- Môi truờng PGA cải tiến (môi trường phân lập và nhân giống cấp 1): nước chiết, Glucose, cao nấm men , Agar.
- Nước chiết gồm có: Giá đỗ, khoai tây, cà rốt.
- Môi trường hạt lúa (môi trường nhân giống cấp hai): Thóc, cám gạo, CaCO3. - Môi trường nuôi trồng ra quả thể: vỏ cà phê, cám gạo, vôi bột, vi lượng (KH2PO4, MgSO4…),DAP
II.2. Phương pháp nghiên cứu
II.2.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1. Khảo sát tốc độ tăng trưởng hệ sợi nấm P. Abalonus trên môi trường thạch (PGA cải tiến)
Mục đích: xác định tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như môi trường nuôi cấy, nhiệt độ ủ tơ.
Tiến hành thí nghiệm
•Pha chế môi trường PGA cải tiến với các thành phần dinh dưỡng như ở
bảng 6. Khoai tây, cà rốt, giá đỗ rửa sạch, cắt nhỏ, nấu chín, lọc kỹ lấy nước, sau đó cho các thành phần còn lại vào nấu tiếp, điều chỉnh đến 1 lít, đợi nguội khoảng 60 – 700C, cho vào ống nghiệm, đĩa petri. Khử trùng bằng nồi Autoclave nhiệt độ 1210C, 1 atm trong 20 phút, để nguội.
•Dùng que cấy, dao mổ và pank tách lấy phần thạch có tơ nấm, rồi cắt thành từng miếng độ 6mm2, cấy vào đĩa petri, ủ tối ở nhiệt độ 27 ± 20C.
•Quan sát và đo tốc độ lan tơ nấm định kỳ 2 ngày/1 lần, rút ra nhận xét kết luận
Bảng 6. Thành phần của môi trường PGA cải tiến
Thành phần Hàm lượng Nước chiết (*) Glucose Agar KH2PO4 Peptone MgSO4 1 lít 20 g 20 g 1 g 1 g 1 g
.
Hình 12: Phân lập giống từ tổ chức mô của nấm bào ngư
1. Que cấy; 2. Tổ chức mô; 3. Nấm bào ngư; 4. Đèn cồn; 5.Ống thạch nghiêng
Thí nghiệm 2. Khảo sát tốc độ ăn sâu của nấm P. Abalonus trên môi trường hạt lúa
Mục đích: xác định tốc độ ăn sâu của tơ chịu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và độ ẩm.
Tiến hành thí nghiệm
•Ngâm lúa khoảng 12 giờ, loại bỏ hạt lép, để ráo nước. Sau đó đun cho đến khi hạt nứt đều, rửa sạch và để cho ráo nước, bổ sung thêm CaCO3 (2%), cho lúa vào bình, ống nghiệm với lượng bằng nhau. Đem hấp khử trùng trong Autoclave ở 1210C, 1 atm trong 60 phút.
•Dùng que cấy, dao và pank tách lấy phần thạch có tơ nấm thành những mẫu khoảng 6mm2 cấy vào môi trường hạt, ủ tối ở nhiệt độ phòng.
•Quan sát và đo tốc độ ăn sâu của tơ nấm trên môi trường hạt định kỳ 5 ngày/1 lần. Rút ra nhận xét kết luận.
Hình 13: Nhân giống cấp hai
Thí nghiệm 3. Khảo sát sự sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm trên môi trường cọng mì
Mục đích: Khảo sát tốc độ ăn sâu của tơ nấm chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ và độ ẩm.
Tiến hành thí nghiệm
•Cọng mì đem chẽ nhỏ chiều dài 9-10cm, phơi khô, sau đó đem ngâm nước vôi 5% trong 12h, vớt ra rửa sạch bằng nước sạch, để ráo nước, phối trộn với các thành phần còn lại trong bảng 7
Bảng 7. Thành phần môi trường nhân giống cấp 3
Thành phần Tỷ lệ (%) Cọng mì Cám gạo CaCO3 Nước 85 10 5 Bổ sung vừa đủ
•Đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 1 giờ, lấy ra để nguội. Cấy giống hạt vào chai thủy tinh có chứa cọng mì với trọng lượng bằng nhau (2 g/chai), ủ tối ở nhiệt độ phòng.
•Quan sát sự phát triển của mẫu cấy trong ba ngày đầu. Loại bỏ các mẫu cấy nhiễm bệnh. Thu nhận các mẫu cấy có khuẩn ty màu trắng, phát triển bình thường làm giống cấp ba.
•Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng.
•Thu nhận kết quả kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào môi trường đến khi ăn trắng toàn bộ chai, đo ngẫu nhiên với thời gian 2 ngày/lần
•Nhận xét đặc điểm phát triển. •Xử lí số liệu vẽ biểu đồ mô tả.
Hình 14: Cấy giống từ chai giống cấp hai sang chai giống cấp ba 1.Chai giống cấp hai; 2. Chai giống cấp ba; 3. Nút bông; 4. Đèn cồn
Thí nghiệm4: Xây dựng quy trình nuôi trồng nấm bào ngư Nhật trên vỏ cà phê Mục đích: Khảo sát khả năng sử sụng vỏ cà phê để nuôi trồng nấm bào ngư Nhật Tiến hành thí nghiệm
Bảng 8. Thành phần môi trường cơ chất tổng hợp Thành phần Tỷ lệ (%) Vỏ cà phê Cám gạo CaCO3 KH2PO4 MgSO4 DAP Chế phẩm Bima Nước 80 10 5 0.1 0.1 0.3 0.5kg/tấn nguyên liệu Bổ sung vừa đủ
Qúa trình chuẩn bị giá thể như sau:
- Vỏ cà phê cho vào bao tải 20kg và ngâm trong nước vôi 10%. Sau ba ngày, lấy bao vỏ cà phê ra và ủ vỏ cà phê thành đống phủ kín bằng bao tải khoảng 2 - 3 ngày để phân giải một phần các hợp chất khó hấp thụ như (cellulose, hemicellulose, lignin…) thành các chất dễ hấp thụ hơn như glucose, đồng thời cũng để cơ chất mềm ra, nấm dễ sử dụng.
- Vỏ cà phê sẽ được sàng để loại bỏ văm, mảnh vụn.
- Bổ sung dinh dưỡng với tỷ lệ như trên, tiến hành đảo trộn đủ ẩm tiếp tục ủ 5-7 ngày.
- Cho cơ chất vào các bịch PP hoặc PE khoảng 1,1 - 1,2 kg.
Mỗi bịch kích thước là 18 x 30cm. Bịch nén xong, tiến hành làm cổ. Cổ bằng giấy bìa cứng, đường kính là 2cm, chiều cao là 4cm. Sau đó cần soi lỗ lại cho rộng để tiện khi cấy giống. Miệng bịch được nhét vải bông không thấm nước . Cuối cùng là dùng giấy dầu bọc miệng bịch lại.
Hình 18: Tạo lỗ hình nón ở giữa bịch phôi
1.Vải bông; 2. Phần giấy dầu xòe ra sau khi buộc chặt, 3. Giống sau khi cấy; 4. Lỗ hình nón
Vỏ cà phê sau khi đóng bịch sẽ được khử trùng ngay.
- Khử trùng bịch cơ chất theo phương pháp hấp khử trùng không áp suất trong lò hấp ở 95 - 100oC trong 12 giờ, sau đó để nguội 24 giờ.
- Để nguội rồi cấy giống cấp ba vào bịch.
- Sau đó tiến hành chuyển bịch phôi vào trong trại ủ tơ nấm trong điều kiện ánh sáng khuếch tán nhẹ ở nhiệt độ 26 - 29 oC, tiến hành quan sát và nhận xét về quá trình phát triển của tơ nấm của đối tượng trên.
Yêu cầu đối với nơi ủ tơ
- Sạch và thoáng mát. Định kỳ được làm vệ sinh bằng formol, nước vôi trong. - Ít ánh sáng nhưng không tối.
- Không bị dột mưa hoặc nắng chiếu.
- Không để chung với đồ đạc sinh hoạt gia đình, vật liệu, sách vở. - Không ủ chung với giàn nấm đang tưới hoặc mới thu hoạch xong.
- Bịch ủ có thể xếp trên kệ. Không chồng chất lên nhau quá nhiều lớp. Không xếp vào ngăn quá kín làm tơ bị ngộp.
- Cứ 5 – 7 ngày tiến hành kiểm tra một lần nhằm phát hiện những bịch nhiễm mốc xanh để huỷ bỏ, không để lây nhiễm sang các bịch khác.
Trong thời gian nuôi ủ tơ nấm, không cần tưới thường xuyên mà chỉ tưới ở nền, xung quanh vách sao cho đảm bảo nhiệt độ và ẩm độ.
Thời gian nuôi ủ tơ nấm bào ngư Nhật khoảng 30 – 40 ngày.
Sau ủ tơ lan trắng đến đáy bịch, bịch phôi sẽ được chuyển vào nhà tưới. Bịch sẽ được rút nút, mỗi ngày tưới 2 - 4 lần để duy trì nhiệt độ thích hợp: 25– 28oC. Độ ẩm không khí cần trong khoảng 80 – 90%.
Hình 19: Tiến hành ủ vỏ cà phê
Hình 20: Xếp bịch phôi lên kệ và ủ
II.2.2. Tính hiệu suất sinh học của nấm bào ngư Nhật trồng trên vỏ cà phê
Hiệu suất sinh học của nấm bào ngư Nhật trên giá thể là tỷ lệ giữa lượng quả thể thu hoạch/lượng cơ chất khô.
Khi nấm ra và đạt kích thước tối đa, bắt đầu có biểu hiện già ta tiến hành thu hái và cân đo.
II.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được, được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học (áp dụng Student Test, P = 0,05). Giá trị thực của một chuỗi thống kê các giá trị thực nghiệm được tính theo công thức:
Trung bình mẫu: X= n x n i i ∑ =1 ∗ Trong đó: X : trung bình mẫu n: tổng số mẫu xi: mẫu đo được
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation):
SD = S = 1 ) ( 1 2 − − ∑ = n X X n i i
PHẦN 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN