Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ:

Một phần của tài liệu Công nghệ protein (Trang 70 - 71)

Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó. Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được. tím của nó. Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được. Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ một sắc ký) thì nồng độ của protein tổng được tính tương đối từ độ hấp thụ. Nguyên tắc của phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine. Độ hấp thụ ở 280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ số tắt đo được (nghĩa là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch.

Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loai protein nào mà không biết hệ số tắt thì nồng độ protein được tính như sau: thì nồng độ protein được tính như sau:

Nồng độ protein (mg/ml)=1,55xA280-0,77xA260

Trong đó: A280: độ hấp thụ ở bước sóng 280nm A260: độ hấp thụ ở bước sóng 260nm A260: độ hấp thụ ở bước sóng 260nm

Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hơn 0,1mg/ml hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ, đệm, acid 0,1mg/ml hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ, đệm, acid nucleic và một số chất béo), hoặc khi protein ở trong dịch truyền phù chứ không phải trong dung dịch. (Ví dụ, trong màng hoặc các phức hợp có trọng lượng phân tử lớn). Cũng cần chú ý là nếu tỷ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein chưa sạch, bị lẫn các chất khác, đặc biệt với acid nucleic thì nên sử dụng phương pháp Lowry để đo nồng độ protein.

Vì vậy, phương pháp đo độ hấp thụ tia cực tím thường được dùng để định lượng protein đã tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc ký tách các đã tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi sắc ký tách các protein qua cột.

Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó. Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tinh khiết hay tính đồng thể của nó. Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau. Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện di trên gel. Chính vì vậy, nếu dùng nhiều loại phương pháp khác nhau để kiểm tra độ sạch của protein mà kết quả đều cho là đồng thể thì protein đó có thể được công nhận là tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng là xây dựng đồ thị về độ hoà tan, điện di và siêu ly tâm.

Một phần của tài liệu Công nghệ protein (Trang 70 - 71)

Tải bản đầy đủ (DOC)

(98 trang)
w