3. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.4.7.Thiết kế thớ nghiệm
3.4.7.1. Thớ nghiệm sàng lọc cỏc loại chế phẩm Bokashi trầu
Thớ nghiệm được tiến hành với 5 nghiệm thức I, II , III, IV, V với cỏc loại chế phẩm Bokashi trầu khỏc nhau. Cỏc thớ nghiệm được bố trớ trờn đĩa thạch. Lấy 100àl dung dich vi khuẩn ở nồng độ 106 CFU/ml dàn đều trờn cỏc đĩa thạch, sau đú để khoảng 5 phỳt cho bề mặt thạch khụ thoỏng, rồi lấy cork (3mm) đục lỗ để tạo nờn cỏc lỗ thạch, đưa cỏc loại dung dich Bokashi của cỏc cụng thức, mỗi cụng thức được lặp lại sỏu lần, đo kớch thước vũng khỏng khuẩn được tạo nờn trờn cỏc đĩa thạch sau 24h , 2 ngày, 7 ngày.
Hỡnh 3. 1. Thử nghiệm khả năng khỏng khuẩn bằng phương phỏp đục lỗ thạch
Cỏc lỗ thạch chứa Bokashi
Chế phẩm Bokashi trầu sử dụng trong thớ nghiệm được sản xuất từ cỏc cụng thức sau
Cụng thức I gồm : 100ml rỉ đường, 1000 gram trầu, 100 ml dấm, 25ml EM1 Cụng thức II gồm: 100ml rỉ đường, 1000 gram trầu, 100ml dấm, 50ml EM1 Cụng thức III gồm: 100ml rỉ dường, 1000 gram trầu, 100ml dấm, 75ml EM1 Cụng thức IV gồm: 100ml rỉ đường, 1000gram trầu, 100ml cồn, 100 EM1 Cụng thức V gồm: 100ml rỉ đường, 1000gram trầu, 100ml dấm, 300 EM1 3.4.8.2. Thớ nghiệm thử nghiệm sàng lọc cỏc nồng độ ức chế
Từ kết quả của thớ nghiệm thứ nhất, tiến hành chọn lấy cỏc cụng thức thớ nghiệm cho kết quả tốt nhất, tiến hành pha loóng thành cỏc nồng độ cần thử để bố trớ thớ nghiệm sàng lọc nồng độ ức chế. Chế phẩm Bokashi trầu với cỏc nồng độ giảm dần (10x và 2x) sẽ được đưa vào cỏc giếng nhựa với thể tớch 2ml, chứa vi khuẩn đó phõn lập được ở mật độ 106CFU/ml. tiếp tục bố trớ thớ nghiệm khả năng khỏng khuẩn như thớ nghiệm trờn và theo dừi trong vũng 7 ngày để xỏc định nồng độ ức chế tối thiểu của Bokashi trầu (Minimal inhibitoring concentration-MIC) 3.4.8.3. Thớ nghiệm khả năng tiờu diệt vi khuẩn
Từ kết quả của thớ nghiệm thứ hai, nồng độ Bokashi trầu cú khả năng khỏng khuẩn tốt nhất sẽ được sử dụng cho thớ nghiệm này. Chế phẩm Bokashi trầu với cỏc nồng độ tăng dần (2 lần) sẽ được đưa vào cỏc giếng nhựa với thể tớch 2ml, chứa vi khuẩn đó phõn lập được ở mật độ 106CFU/ml. Sau khi bổ sung chế phẩm Bokashi 30 phỳt, 1h, 2h, 12h, lấy 100μl dung dịch trong cỏc giếng nhựa cấy lờn mụi trường thạch TCBS để kiểm tra sự phỏt triển trở lại của vi khuẩn để xỏc định nồng độ tiờu diệt vi khuẩn tối thiểu của chế phẩm (Minimal bactericidal concentration-MBC)
Hỡnh 3. 2. Sơ đồ nghiờn cứu tổng thể
Thu mẫu bệnh phẩm Lấy mẫu bệnh phẩm Nuụi cấy trờn TCBS
Khuẩn lạc vi khuẩn phõn lập được
Thử phản ứng sinh hoỏ
Nuụi cấy tăng sinh Thử mức độ khỏng
khuẩn của Bokashi trầu
Thử khả năng diệt khuẩn của Bokashi
trầu
Thử nghiệm khả năng phỏt triển trở lại sau khi ngõm vào dung dich Bokashi trầu
Thử độ nhạy cảm khỏng sinh
3.5. Phương phỏp xử lý số liệu 3.5.1. Giỏ trị trung bỡnh X = n Xi n i ∑=0 Trong đú: X : Giỏ trị trung bỡnh Xi : Giỏ trị của mỗi lần đo n : Số lần đo 3.5.2. Độ lệch chuẩn n X Xi ∑ − = 2 ) ( σ Trong đú: X : Giỏ trị trung bỡnh σ : Độ lệch chuẩn n :Số lần đếm
Xi: Giỏ trị trung bỡnh
3.5.3. Cụng thức tớnh mật độ vi khuẩn X = K V A . Trong đú: X: mật độ vi khuẩn
A: Số lượng khuẩn lạc trung bỡnh trong 1 độ pha loóng V: Thể nước đưa vào nuụi cấy
K: Hệ số pha loóng
3.5.4. Xử lớ số liệu
Số liệu được xử lý theo phương phỏp thống kờ sinh vật học trờn phần mềm Excel.