- Môi trường Raper dùng để nuôi cấy, nhân giống, khảo sát sự tăng trưởng giống, giữ giống (Raper 1966) Thành phần gồm:
a. Khảo sát khả năng phân hủy của nấm Trichoderma
Bảng: Các phương pháp xác định hoạt tính cellulase Đo hoạt tính Cơ chất Phương pháp xác
định Tác giả
Hoạt tính hòa tan
Giấy lọc Aicel Cellulose azur Giảm trọng lượng Đo mật độ quang Đo mật độ quang Halliwell v Riaz (1970) Lrisola v Linko (1976) Leisola v Linko (1976) Endoglucanase CMC, HEC Đường khử Mandel v Weber (1969)
Cellulose tẩm H3PO4
Giảm độ nhớt Almin v Eriksson(1967) Exoglucanase Avicel, giấy
lọc Đường khử
Mandels v Weber (1969)
Beta-glucosidase Cellobiose Glucose Selby v Maitland (1967)
Wood và McCrae (1972) đã chứng minh rằng hoạt tính exoglucanase (được tinh chế) có khả năng phân cắt mạch cellulose (được xử lí với acid phosphoric) nhưng hoạt động trên CMC rất chậm. Sản phẩm phần lớn là cellobiose (95%).
Endoglucanase phân cắt ngẫu nhiên các liên kết beta-1,4-glucosid ngay ở vùng trong của chuỗi cellulose được xử lí với acid phosphoric và cũng phân cắt các dẫn xuất của cellulose như CMC và HEC (hydroxylethyl cellulose).
Vì bản chất của cơ chất lẫn enzyme đều phức tạp, nên việc phân tích hoạt lực cellulase cũng không đơn giản. Cellulase thu nhận được từ các vi sinh vật khác nhau cho thấy có nhiều dữ liệu khác nhau. Thành phần của enzyme từ cùng một chủng vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào phương pháp lên men, thành phần môi trường và các điều kiện lên men.
Cơ chất để phân tích hoạt động phối hợp của endoglucanase, exoglucanase và beta-glucosidase là cellulose tinh thể không tan như Avicel, Solkfloc và đặc biệt là giấy lọc. Tuy nhiên, việc tiêu chuẩn hóa các cơ chất này rất khó, vì bản chất đại phân tử của chúng như mức độ polyme hóa, mức độ tinh thể, mức độ tinh sạch và nguồn gốc của cơ chất, tất cả đều ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Các cơ chất phân tử nhỏ như p-nitrophenol-beta-glucosidase, cellobiose hoặc oligocellulodextrin là cơ chất lí tưởng để chuẩn hóa việc phân tích hoạt tính cellulase. Tuy nhiên, các cơ chất này không thích hợp cho họat động phối hợp của cả hệ cellulase mà chỉ thích hợp cho beta-glucosidase.
Pha môi trường CMC, hấp khử trùng ở 1210C/15 phút, đổ vào đĩa petri vô trùng một lớp thạch dày khoảng 2 – 5 mm. Chờ cho môi trường đông đặc lại, dùng que cấy móc lấy một ít bào tử nấm mốc từ ống giống cấy vào ngay giữa đĩa thạch một điểm. Ủ ở nhiệt độ phòng trong hai ngày, sau đó nhuộm đĩa bằng thuốc thử Lugol. Quan sát và đo vòng phân giải CMC của các chủng nấm mốc.
b. Khảo sát tính kháng nấm bệnh của chủng TRICHODERMA
Pha môi trường PGA, sau khi hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C/25 phút, đổ vào các đĩa petri vô trùng một lớp thạch dày khoảng 2 – 5 cm. Vẽ trên nắp đĩa một đường
kia sẽ cấy một chủng nấm bệnh. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 ngày rồi quan sát sự ăn tơ của các chủng nấm mốc với nấm bệnh fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ ở cây trồng.
IV.3 Phương pháp ủ COMPOST:
Rác thải sinh hoạt được thu gom về sau đó tách lựa thủ công. Dùng dao xé các bao nilon đựng rác ra, sau đó tách lựa các loại rác vô cơ khó phân hủy như túi nilon, kim loại, cao su (vỏ xe, ruột xe...), các loại cây que lớn, thủy tinh, chai lọ....đem đi chôn lấp. Sau đó dùng dao và thớt để băm nhỏ rác. Trộn đều rác cùng với rơm đã băm nhỏ, mục đích để tạo điều kiện cho xạ khuẩn phát triển. Trộn meo giống chủng
Phanerochaete chrysosporium dạng bịch mạt cưa.
Rác sau đó được phun chế phẩm EM khử mùi theo công thức ghi trên hộp (10ml pha loãng ra 1000ml, phun cho 100kg rác). Đem rác ra ủ thành đống chiều cao 1 mét. Phun EM khử mùi 3 ngày liên tục, 3 lần/1 ngày để khử mùi, không làm ảnh hưởng đến các hộ gia đình xung quanh. Dùng 3 nhiệt kế thủy ngân cắm vào đống rác để đo nhiệt độ trong quá trình ủ. Ghi nhận lại sự biến thiên nhiệt độ tới khi nhiệt độ không còn biến thiên nữa.
Do điều kiện ủ là hiếu khí nên đống ủ thường xuyên được đảo trộn, 3-4 ngày đảo 1 lần. Sau khi nhiệt độ đống ủ không còn biến thiên nữa, ta bổ sung chế phẩm BIMA (nấm Trichoderma). Sở dĩ ta không bổ sung Trichoderma ngay từ đầu là vì trong quá trình nhiệt độ lên cao sẽ làm bất hoạt khả năng phân hủy của nấm
Trichoderma. Tỉ lệ trộn là 1/20. Song song với ủ 3 đống như vậy, ta ủ một đống rác tương tự như trên nhưng không bổ sung VSV, chỉ để phân hủy tự nhiên.
Nhiệt độ tạo ra do quá trình chuyển hóa sinh học trong khối chất thải ủ đóng vai trò quan trọng là tạo điều kiện tối ưu cho quá trình phân giải. Tạo ra những chất an toàn cho VSV sử dụng. Khi nhiệt độ tăng lên 60-650C sẽ làm giảm quá trình oxy hóa sinh học, nhiệt độ thuận lợi cho các phản ứng sinh học trong khối chất thải ủ là
550C. Các VSV có tác dụng thúc đẩy các quá trình oxy hóa sinh học vừa có tác dụng tiêu diệt các VSV gây bệnh. Nhiệt độ được điều chỉnh bằng hai yếu tố là cường độ thổi khí và độ ẩm khối ủ. pH tối ưu cho quá trình ủ nằm trong khoảng trung tính, khi acid hữu cơ bay hơi tạo ra thì pH trong khối ủ sẽ giảm. Sau một thời gian nhất định, pH lại trở về vùng trung tính.
Sau thời gian ủ 1 tháng, kiểm tra độ phân hủy của 2 đống ủ bằng cách lấy mẫu tại 5 vị trí trong đống ủ (ở tâm và 4 vị trí cách đều tâm), sau đó trộn đều, giảm ẩm xuống còn 20%. Cân 3kg (Mm) mẫu cho vào bao có tráng PE bên trong. Dùng vật cứng đập đều bên ngoài bao. Lấy toàn bộ mãu trong bao sau khi xử lý cho qua sàng 1.5x1.5mm. Cân khối lượng dưới sàng (Md). % độ phân giải tính bằng công thức:
Độ phân giải (%) = Md/Mm
Nếu đạt yêu cầu thì ta đem toàn bộ đống ủ ra 1 sân xi măng phơi khô giảm ẩm, đây được gọi là giai đoạn ủ chín. Thời gian ủ chín là 10 ngày. (Phơi nắng 10 ngày liên tục), giảm ẩm xuống còn 30%.
Tiếp theo đó, ta gom rác ủ chín đã phơi khô, cho vào 1 bao tải dùng gậy đập nhuyễn. Trong công nghiệp sản xuất thì khâu này dùng máy nghiền. Rác được đậïp nghiền nhỏ và được sàng thủ công với loại sàng cấp 1 có đường kính mắt là 10mm, ta thu được sản phẩm mùn thô. Mùn thô tiếp tục cho qua sàng cấp 2 có đường kính mắt là 1.5x1.5mm, thu được sản phẩm là mùn tinh.
Đo các chỉ tiêu dinh dưỡng N, P, K trong mùn tinh, bổ sung thêm cho đủ tiêu chuẩn, tạo viên và đóng gói thành phẩm.
IV.4 Phương pháp đo N, P, K tổng
IV.4.1 Phương pháp đo N tổng bằng phương pháp Kjeldhal Nguyên tắc:
Hàm lượng Nitơ tổng số được xác định theo phương pháp Kjeldhal. Chuyển toàn bộ nitơ trong mẫu thành dạng amôsulfat giải phóng NH3 bằng kiềm, hấp thu NH3 bằng dụng dịch Axit Boric.
Nitơ hữu cơ trong mẫu được oxi hóa bằng H2SO4 đặc và sự có mặt cảu các chất xúc tác (CuSO4, selen) chuyển thành Nitơ ở dạng (NH4)2SO4 trong dung dịch.
CH2NH2COOH + 3H2SO4 = 2CO2 + NH3 + H2O + 3SO2 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4
Phần nhỏ lượng nitơ NO3- trong mẫu cũng được chuyển thành NH3 khi có mặt phenol
C6H4(OH)HSO3 + HNO3 = C6H4(OH)NO2 + H2SO4 H2SO4 + Zn = ZnSO4 + H2
C6H4(OH)NO2 + 3H2 = C6H4(OH)NH2 + 2H2O
Quá trình tro hoá tiếp tục thì nitơ nhóm amin chuyển thành ammoniac liên kết với H2SO4 thành (NH4)2SO4.
Cách tiến hành:
Cân 0.1g mẫu cần phân tích vào bình Kjeldhal 250ml (không cho mẫu dính vào thành bình). Rót vào 5ml H2SO4 đâm đặc, lắc nhẹ và đều. Thêm vào 0.05 g CuSO4 và 0.15g K2SO4, đun nhệ trên ngọn lửa, sau đó đun sôi cho đến khi dung dịch trong bình trắng hoàn toàn. Lấy bình ra khỏi bếp để nguội và chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 100ml, định lức đúng 100 ml. Cho 50ml dung dịch mẫu vào bình cất dụng cụ Kjeldhal có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro trong bình (có màu xanh nhạt). Sau đó rót cẩn thận 15ml NaOH 40% vào bình cất. Đồng thời lấy 20ml H2SO4 0,1 N có 2-3 giọt thuốc thử Tashiro để hấp thụ NH3 thoát ra khi cất. Đun sôi NH3 cho đến khi thể tích trong bình cất còn dưới 2/3, hạ thấp bình hấp thụ để lấy những giọt cuối cùng chảy ra từ ống sinh hàn. Thử bằng quì tím tại đầu ra của ống, nếu quì tím không đổi màu là đạt. Chuẩn độ H SO dư trong bình hứng bằng NaOH
0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1N sử dụng. Tình kết quả: 1.42(VH2SO4 – VNaOH) x 2 x100 N VH2SO4 : số ml H2SO4 0,1 N lấy để hấp phụ VNaOH : số ml NaOH tiêu tốn khi chuẩn n: khối lượng mẫu lấy để phân tích
1,42 hệ số; cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42mg Nitơ.
IV.4.2 Phương pháp đo P tổng
Mẫu phân đã nghiền nhỏ, trộn đều, từ đó chọn mẫu để phân tích Cân 2g mẫu khô cho vào bình kjeldahl 500ml.
Cho vào bình 20 – 25ml hỗn hợp H2SO4 + HNO3, đun trên bếp điện.
Trong khi tro hóa, theo định kỳ lắc bình và bổ sung 1 – 1.5ml HNO3 đặc, vì HNO3 bay hơi.
Mỗi lần cho axit HNO3 phải để bình nguội. Khi không có khí màu nâu thoát ra thì cần thiết phải thêm HNO3.
Quá trình tro hóa kết thúc khi dung dịch trong bình có màu trắng.
Sau khi tro hóa xong, để nguội bình rồi thêm vò bình 100ml nước đun đến sôi để loạt trừ bớt HNO3.
Lọc để loại trừ phần kết tủa trong dung dịch như axit sillic, thạch cao, cát, sét, rửa phần cặn trên giấy lọc bằng nước cất nóng. Dịch lọc và nước rửa định vào bình định mức 200ml, định mức tới vạch, lắc đều. Dung dịch sẽ chia thành hai phần, một phần để xác định kali.
Lấy 20ml dung dịch trên cho vào bình định mức 200ml định mức bằng nước tới vạch. Dung dịch đã pha loãng 10 lần này dùng để xác định so màu photpho.
Tiếp theo chuẩn bị đường cong chuẩn theo bảng sau:
STT 0 1 2 3 4 5 6 ml dd P- PO4 chuẩn 0 1 2 3 4 5 - ml nước cất 50 49 48 47 46 45 - ml mẫu photpho 0 0 0 0 0 0 50 ml dd molybdate 2.0 ml ml SnCl2 0.25 ml = 5 giọt C (μg) 0 2.5 5 7.5 10.0 12.5 C (mg/l) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Độ hấp thu đo bằng máy bước sóng 690nm ? ? ? ? ? ? ?
Từ loạt dung dịch chuẩn, đo độ hấp thu, vẽ giản đồ A = f(C), sử dụng phương pháp bình phương cực tiểu để lấp phương trình y = ax + b. Từ độ hấp thu Am của mẫu, tính nồng độ Cm. Sau đó tính được hàm lượng photpho tổng.
Đường chuẩn y = 1.2229x – 0.0009 Với R2 = 0.9942
Chương 5: