3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc đến khả năng tổng hợp PME của A.niger
3.3.1.1 Mục đích
Xác định cơ chất thích hợp và tỷ lệ pha loãng sử dụng cho việc trích ly PME có hoạt tính cao nhất.
3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố A: tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc.
A1 = 1: 2 A2 = 1: 3 A3 = 1: 4 A4 = 1: 5 A5 = 1: 6 Số nghiệm thức: 5
Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 = 15 mẫu
3.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm
Cân 5 g bột táo cho vào bình nón 100 mL, thêm nƣớc với các tỉ lệ khác nhau (1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5 và 1: 6) sau đó thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Làm mát, cho 2 mL huyền phù bào tử với mật số cố định là 103
nhiệt độ phòng trong thời gian 96 giờ. Đo độ ẩm đạt đƣợc của mỗi bình để làm thông số theo dõi. Tỉ lệ bột táo và nƣớc cho enzyme PME có hoạt tính cao nhất sẽ đƣợc chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 9: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc
3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi
Độ ẩm môi trƣờng và hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiê ̣m thƣ́c thí nghiệm.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến khả năng tổng hợp PME
của nấm mốc Aspergillus niger
3.3.2.1 Mục đích
Xác định thời gian ủ thích hợp cho nấm mốc phát triển sinh tổng hợp PME đạt hiệu suất và hoạt tính cao nhất.
Môi trƣờng Pha loãng
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
Aspergillus niger
Ủ
Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase Thanh trùng
3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí có một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố B: Thời gian ủ ( giờ)
B1= 48 giờ B2= 72 giờ B3= 96 giờ B4=120 giờ B5= 144 giờ Số nghiệm thức: 5
Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 = 15 mẫu
3.3.2.3 Tiến hành thí nghiệm
Cân 5 g bột táo cho vào bình nón 100 mL, thêm nƣớc theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm trên. Sau đó tiến hành thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Làm mát các bình này sau khi thanh trùng, kế đến cho 2 mL huyền phù bào tử (103
cfu/mL) vào mỗi bình. Các bình cấy đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo hoạt tính ở các mức thời gian khảo sát. Chọn thời gian tối ƣu nhất sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Hình 10: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Môi trƣờng Pha loãng Làm nguội Thanh trùng Thu nhận enzyme
Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase
Aspergillus niger Nuôi cấy vi sinh vật
Ủ
3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dõi
Hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiê ̣m thƣ́c thí nghiê ̣m.
3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng tổng hợp
PME của nấm mốc
3.3.3.1 Mục đích
Xác định điều kiện môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp pectinmethylesterase là tốt nhất.
3.3.3.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố C: giá trị pH của môi trƣờng.
C1 = 3,5 C2 = 4,0 C3 = 4,5 C4 = 5,0
Số nghiệm thức: 4
Số mẫu thí nghiệm: 4 x 3 = 12 mẫu.
Hình 11: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của pH đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc
Môi trƣờng Pha loãng
Thu nhận enzyme
Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase
Aspergillus niger
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật Ủ
Thanh trùng Dung dịch đệm citrate
Chỉnh pH
3.3.3.3 Tiến hành thí nghiệm
Cân 5 g bột bã táo cho vào bình nón 100 mL, pha loãng với dung dịch đệm citrate theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm trên. Giá trị pH trung bình sau khi pha loãng đƣợc điều chỉnh về 3,5; 4,0; 4,5; 5. Đem thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi làm mát và cấy 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL), các bình đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng và thời gian tối thích ở thí nghiệm trên.
3.3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi
Hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiê ̣m thƣ́c thí nghiê ̣m.
Giá trị pH của dung dịch đệm cho hoạt tính PME cao nhất đƣợc chọn làm nhân tố cố định cho các thí nghiệm sau.
3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ amonium sulfate (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng sinh PME từ nấm mốc A.niger
3.3.4.1 Mục đích
Tìm ra tỉ lệ amonium sulfate bổ sung thích hợp nhất cho khả năng tổng hợp PME từ nấm mốc A.niger.
3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố D: Tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung (tính theo % nitơ)
D1 = 0,1% D2 = 0,2 % D3 = 0,3 %
Số nghiệm thức: 3
Số mẫu thí nghiệm: 3 x 3 = 9 mẫu.
3.3.4.3 Tiến hành thí nghiệm
Cho vào mỗi bình nón 5 g bột bã táo, pha loãng theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm 1 với dung dịch đệm citrate có pH tối thích ở thí nghiệm trên, và bổ sung amonium sulfate theo các tỉ lệ khảo sát, đem thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó làm mát và cấy 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL), đem ủ ở nhiệt độ phòng và thời gian tối thích nhất.
3.3.4.4 Chỉ tiêu theo dõi
Hình 12: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của amonium sulfate (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Môi trƣờng Pha loãng Dung dịch đệm Bổ sung (NH4)2SO4 Thanh trùng Làm nguội Cấy vi sinh vật Thu nhận enzyme Aspergillus niger Ủ
Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA TỈ LỆ PHA LOÃNG GIỮA CƠ CHẤT VÀ NƢỚC
Tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc chiếm vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp PME từ nấm mốc. Tỉ lệ pha loãng thích hợp sẽ tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tối ƣu để sinh PME. Do đó, thí nghiệm đƣợc tiến hành để khảo sát các tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất bã táo và nƣớc khác nhau (1: 2; 1: 3; 1: 4; 1: 5 và 1: 6) đến hiệu quả sinh PME từ A.niger. Ở thí nghiệm này, mật số nấm mốc đƣợc cố định là (103 cfu/mL), thời gian ủ 4 ngày ở nhiệt độ phòng.
Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc đến khả năng sinh PME của nấm mốc đƣợc thể hiện qua bảng số liệu 4 và hình 13.
Bảng 4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc đến khả năng sinh PME
Tỉ lệ pha loãng Độ ẩm Hoạt tính (U/mL)
1: 2 1: 3 1: 3 1: 4 1: 5 1: 6 51,61% 2,89 55,72% 2,50 63,45% 2,85 68,81% 2,61 74,16% 2,16 235,70c 3,55 325,94a 8,31 256,67b 5,67 228,87c 4,23 211,31d 4,84
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% . Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại.
Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại.
Từ kết quả của bảng 4 cho thấy, ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc có tác động lớn đến khả năng sinh PME của nấm mốc, thể hiện ở hoạt tính khác nhau.
Kết quả cho thấy hoạt tính của A. niger PME tăng từ tỉ lệ pha loãng 1: 2 lên đến giá trị 1: 3 và sau đó lại giảm dần khi mức độ pha loãng tăng đến tỉ lệ 1: 6. Trong đó, tỉ lệ pha loãng 1: 3 cho hoạt tính PME đạt cực đại (325,94 8,31 U/mL) và khác biệt có ý nghĩa khi so sánh với các mức độ cao hay thấp hơn.
Độ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Vì vậy, nếu độ ẩm môi trƣờng không thích hợp thì vi sinh vật sẽ khó tiếp nhận thức ăn, nên không phát triển đƣợc làm kìm hãm sự tổng hợp enzyme.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 Tỉ lệ pha loãng H oạt tí n h P M E ( U /mL)
Hình 13: Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa nƣớc và cơ chất đến hoạt tính PME
Theo Nguyễn Đức Lƣợng (2004) thì khi độ ẩm môi trƣờng cao (từ 60%) thì làm giảm mức độ thoáng khí và cũng tạo điều kiện cho một số vi khuẩn, nấm mốc khác phát triển. Ngƣợc lại, độ ẩm thấp (50%) làm môi trƣờng nuôi cấy khô, nấm mốc không có điều kiện thoáng khí để sinh bào tử, nên hoạt tính enzyme cũng thấp. Tƣơng ứng với tỉ lệ pha loãng của cơ chất bã táo: nƣớc là 1: 3, độ ẩm của môi trƣờng là 55,72 ± 2,50%, thích hợp cho nấm mốc phát triển tối ƣu để tổng hợp nhiều enzyme. Kết quả này trùng khớp với nghiên cứu của Joshi (2006) trên cơ chất bã táo ở tỉ lệ pha loãng 1: 3 là tối ƣu cho sự sinh tổng hợp PME và của Sun Zhong-Tao (2008) với độ ẩm môi trƣờng ban đầu là 55% thì sẽ tạo điều kiện tối ƣu cho nấm mốc phát triển sinh PME có hoạt tính cao. Chính vì thế, tỉ lệ pha loãng của bã táo: nƣớc là 1: 3 đƣợc lựa chọn làm nghiệm thức tối ƣu cho các nghiên cứu kế tiếp.
Bên cạnh ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng lên men, các yếu tố khác nhƣ thời gian ủ, pH hay thành phần dƣỡng chất thích hợp cho hiệu quả sinh enzyme hoạt tính cao cũng cần đƣợc quan tâm.
4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PME CỦA
NẤM MỐC A. NIGER
Thời gian nuôi cấy là một trong những nhân tố quyết định hoạt tính enzyme cao hay thấp do hoạt tính của enzyme phụ thuộc rất lớn vào sự phát triển của tế bào nấm mốc. Do đó, thí nghiệm đƣợc tiến hành để khảo sát thời gian nuôi cấy nấm mốc (48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ và 144 giờ), từ đó tìm ra đƣợc thời gian thích hợp cho nấm mốc phát triển tối ƣu để sinh PME. Trong nghiên cứu này, mật số nấm mốc vẫn đƣợc cố định (103 cfu/mL), tỉ lệ pha loãng của bã táo và nƣớc là 1: 3 để tiến hành khảo sát sự thay đổi hoạt tính PME sinh ra theo thời gian ủ ở nhiệt độ phòng. Kết quả đƣợc tính toán thống kê, thể hiện ở bảng 5 và hình 14.
Bảng 5: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến hoạt tính của PME sinh ra từ A. niger
Thời gian ủ, giờ Hoạt tính PME (U/mL)
48 72 96 120 144 72,15e 6,36 139,49d 6,36 313,45a 7,73 222,06b 14,69 202,82c 9,11
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% . Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại.
Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại.
0 50 100 150 200 250 300 350 48 72 96 120 144
Thời gian (giờ)
H oạt tí n h P M E ( U /mL)
Từ kết quả ở bảng 5 và hình 14 cho thấy, hiệu quả thu nhận PME tăng dần theo thời gian ủ từ 48 giờ (72,15 6,36 U/mL) đến 96 giờ (313,45 7,73 U/mL), sau đó giảm dần. Ứng với thời gian ủ 48 giờ, nấm mốc A. niger ở giai đoạn này bắt đầu thích nghi với điều kiện môi trƣờng nên chúng chƣa gia tăng mật số đáng kể, quá trình sinh tổng hợp enzyme đang ở giai đoạn khởi đầu, dẫn đến hiệu suất và hoạt tính PME thu đƣợc khá thấp. Thời gian lên men phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhƣ đặc tính môi trƣờng, giống nấm mốc, hàm lƣợng dƣỡng chất và điều kiện sinh lý quá trình ủ.
Theo nghiên cứu của Aguilar và Huitron (1990); Galiotou-Panayotou và Kapantai (1993); Solis-Pereyra et al, (1993); Taragano et al, (1997) cho thấy, thời gian ủ tối ƣu cho quá trình lên men rắn A.niger sinh PME thay đổi trong khoảng 90 đến 120 giờ. Trong giai đoạn này nấm mốc đã hoàn toàn thích nghi với điều kiện môi trƣờng và gia tăng mật số rất nhanh, đồng thời với việc tổng hợp enzyme tăng mạnh. Đây chính là thời điểm tốt nhất để thu chế phẩm enzyme. Vì sau giai đoạn tăng trƣởng nấm mốc sẽ chuyển sang giai đọan suy vong, số bào tử chết đi nhiều hơn số bào tử mới hình thành trong điều kiện cơ chất đã cạn kiệt nên không thể tăng trƣởng đƣợc nữa (Lê Xuân Phƣơng, 2007). Do đó, nếu tiếp tục kéo dài thời gian nuôi cấy thì hoạt tính PME sẽ giảm xuống.
Tóm lại, thời gian 96 giờ là thích hợp nhất để thu chế phẩm enzyme, đây cũng là thời gian ủ tối ƣu tƣơng đồng với nghiên cứu của Joshi (2006) trên cơ chất bã táo cũng nhƣ khảo sát của Patil và Dayanand (2006) khi khảo sát khả năng sinh PME từ
A.niger với cơ chất là dầu hạt hƣớng dƣơng.
4.3 ẢNH HƢỞNG CỦA SỰ THAY ĐỔI pH MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ
NĂNG SINH PME TỪ ASPERGILLUS NIGER
Điều kiện pH của môi trƣờng cũng là một trong những nhân tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh PME của nấm mốc, ở giá trị pH thích hợp nấm mốc sẽ phát triển và gia tăng mật số nhanh chóng nên sinh tổng hợp đƣợc PME có hoạt tính cao hơn. Vì nấm mốc thích hợp trong môi trƣờng acid yếu (Lê Xuân Phƣơng, 2007) nên thí nghiệm đƣợc tiến hành để nghiên cứu ảnh hƣởng của việc thay đổi pH môi trƣờng (ở các mức thay đổi 3,5; 4,0; 4,5 và 5,0) đến khả năng sinh PME từ Aspergillus niger. Trong nghiên cứu này, mật số nấm mốc vẫn đƣợc cố định (103 cfu/mL), để ủ trong 96 giờ ở nhiệt độ phòng, tiến hành khảo sát sự thay đổi hoạt tính PME sinh ra theo pH của môi trƣờng. Kết quả đƣợc trình bày qua bảng số liệu 6 và hình 15.
Bảng 6: Ảnh hƣởng của sự thay đổi pH môi trƣờng đến khả năng tổng hợp PME của A. niger
pH dung dịch đệm pH môi trƣờng Hoạt tính PME (U/mL) Nƣớc cất 3,0 4,0 5,0 6,0 Đối chứng (4,8) 3,5 4,0 4,5 5,0 297,42cd 7,35 331,89 b 8,67 365,56a 6,36 304,63c 6,05 286,20d 8,67
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% . Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại.
Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 3.5 4 4.5 4.8 5 pH mẫu H oạt tí n h P M E ( U /mL)
Hình 15: Ảnh hƣởng của pH đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc
Từ số liệu ở bảng 6 và hình 15 cho thấy, tƣơng ứng với pH = 4,0 của môi trƣờng, enzyme PME thu đƣợc có hoạt tính cao hơn so với các pH môi trƣờng khác (365,56
6,36 U/mL). PME thu đƣợc khi lên men ở điều kiện pH môi trƣờng bằng 4,5 có
hoạt tính không khác biệt ý nghĩa so với mẫu có pH = 4,8 (mẫu đối chứng) nhƣng lại có hoạt tính cao hơn mẫu có pH = 5. Nhƣ vậy, hoạt tính của enzyme giảm dần khi pH môi trƣờng tăng cao hơn 4,0. Điều này có thể giải thích do vai trò của ion hydro nằm trong thành phần môi trƣờng làm thay đổi trạng thái diện tích của thành tế bào. Tùy theo nồng độ của chúng mà làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào nấm mốc (Lê Xuân Phƣơng, 2007). Vì vậy, ở một giá trị pH nhất định thì khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc sẽ đạt tối ƣu.
Ở giá trị pH trong khoảng 4,5 ÷ 5,0, tuy sự hình thành bào tử và giai đoạn tăng trƣởng của nấm mốc không bị ảnh hƣởng nhƣng sự tạo thành enzyme bị kìm hãm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) nên enzyme đƣợc tạo thành có hoạt tính không cao. Nghiên cứu của Sun Zhong-Tao (2008) trên cơ chất bã táo cũng cho thấy pH môi trƣờng bằng 4,0 là thông số tối ƣu cho việc sinh tổng hợp các enzyme pectinase của nấm mốc A. niger.
Từ các kết quả đã nhận đƣợc qua khảo sát, điều kiện pH môi trƣờng nuôi cấy bằng 4,0 đƣợc chọn lựa là thông số thích hợp cho sự sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger.
4.4 ẢNH HƢỞNG CỦA AMONIUM SULFATE (NH4)2SO4 BỔ SUNG ĐẾN