Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc gọi là chế phẩm thô vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng.
Tùy theo mục đích sử dụng, có thể dùng chế phẩm thô này ngay không cần qua quá trình tinh sạch. Trong những trƣờng hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme. Khi enzyme đƣợc tách hết nƣớc, sinh khối vi sinh vật và thành phần môi trƣờng và chúng ở dạng tinh thể, ta thu đƣợc chế phẩm enzyme sạch.
Để thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme PME tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải đƣợc trích ly bằng phƣơng pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối trung tính. Muối trung tính nhƣ amonium sulfate, natri chloride thƣờng đƣợc sử dụng để kết tủa enzyme vì độ hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ, không làm biến tính enzyme, enzyme thu đƣợc có hoạt tính cao hơn so với các enzyme thu đƣợc bằng phƣơng pháp sử dụng dung môi hữu cơ. Tuy nhiên, khi sử dụng muối trung tính cũng có nhƣợc điểm là lƣợng dung dịch dùng gấp 5 ÷ 6 lần dịch chiết enzyme và không thể tái thu hồi đƣợc dung môi.
Để đảm bảo chế phẩm enzyme thu đƣợc không mất hoạt tính nhanh, ngƣời ta thƣờng sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp. Độ ẩm cần đạt sau khi kết thúc quá trình sấy thƣờng nhỏ hơn 10 %. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi, ta thƣờng sấy enzyme ở nhiệt độ 38 ÷ 40o
C. Ở nhiệt độ này phần lớn enzyme ít bị biến đổi. Trong trƣờng hợp sấy ở nhiệt độ cao quá 40o
C, enzyme rất dễ bị biến tính (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.4.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp PME
2.4.5.1 Ảnh hưởng của loại nguyên liệu
Thành phần môi trƣờng là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng nhƣ các enzyme khác tƣ̀ vi sinh vâ ̣t . Trong đó , thành phần pectin giữ vai trò rất quan tro ̣ng (Patil, 2006). Hàm lƣợng pectin cao đƣợc biết đến nhƣ nguồn cơ chất thích hợp cho việc sản xuất pectinase nguồn gốc vi sinh.
2.4.5.2 Độ ẩm
Độ ẩm cao ảnh hƣởng đến độ thoáng khí, thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi cũng nhƣ khả năng tạo enzyme.
Theo Nguyễn Đức Lƣợng (2004) trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trƣờng là 58 ÷ 60% và phải giữ cho độ ẩm của môi trƣờng ổn định trong quá trình nuôi.
Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50 55% thì sẽ kiềm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật cũng nhƣ tạo enzyme (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Khi nuôi cấy trong điều kiện không đƣợc vô trùng tuyệt đối thì độ ẩm môi trƣờng sau khi cấy giống không đƣợc vƣợt quá 60%, vì cao hơn sẽ dễ bị nhiễm khuẩn.
2.4.5.3 Nhiệt độ nuôi
Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme. Nấm mốc Aspergillus niger phát triển thích hợp ở nhiệt độ 30oC (Schmitz, 2002).
2.4.5.4 Thời gian nuôi
Thời gian nuôi để thu đƣợc lƣợng enzyme lớn thƣờng đƣợc xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tƣợng không mong muốn vì thƣờng làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo enzyme cực đại thƣờng kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.4.5.5 pH
Khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt thƣờng ít ảnh hƣởng do môi trƣờng có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trƣờng có ảnh hƣởng không nhỏ đến sự phát triển của nấm sợi và sự tạo thành enzyme. pH tối thích của enzyme có nguồn gốc vi sinh vật trong khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch, 2007).
2.5 MỘT SỐ KẾT QUẢ ĐÃ NGHIÊN CỨU
Sun Zhong-Tao (2008) đã nghiên cứu sản xuất pectinase từ hai dòng Aspergillus niger đã đƣợc phân lập trên cơ chất bã táo (apple pomace). Nghiên cứu sản xuất PME từ Curvularia inaequalis trên cơ chất vỏ cam trong môi trƣờng rắn cũng đã đƣợc Afifi et al. (2002) nghiên cứu. Nhìn chung, đặc điểm thành phần cơ chất giàu pectin và điều kiê ̣n môi trƣờng là yếu tố chi phối ma ̣nh đến hiê ̣u quả lên men sinh PME tƣ̀ vi sinh vâ ̣t.
Với thành phần pectin trong ha ̣t hƣớng dƣơng là 21,36%, Patil và Dayanand (2006) đã xác nhận tính khả thi của việc sử dụng hạt hƣớng dƣơng trong sản xuất PME từ
Aspergillus niger cho cả hai trƣờng hợp lên men rắn và lên men chìm.
PME đã đƣợc phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991), đặc biệt là Aspergillus niger đã đƣợc khảo sát khá chi tiết với hai phƣơng thức lên men chìm và lên men nổi (Joshi et at., 2006) trên nhiều loại cơ chất khác nhau (Schmitz, 2002).
Theo Trần Xuân Ngạch (2007), PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thích trong khoảng từ 30 – 45oC và bị vô hoạt ở 55 62oC và đƣợc hoạt hóa bởi Ca2+ và Mg2+. Phƣơng pháp trích ly PME cũng đƣợc nghiên cứu (Contreras–Esquivel, 1999). Kết quả cho thấy dung dịch NaCl 0,5% và 0,1% đƣợc sử dụng trích ly PME từ vỏ quả chanh (Mexico lime) và vỏ quả lê (prickly pear) cho hiệu quả trích ly cao nhất. Sử dụng bã táo (apple pomace) nhƣ nguồn cơ chất cho sự phát triển của A. niger
sinh PME cũng đã đƣợc chứng minh bởi Joshi (2005). Nghiên cứu của Joshi (2006) về việc sản xuất pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo cho thấy, nhiê ̣t đô ̣ ủ 25oC, điều kiện pH phản ƣ́ng 4,0 và thời gian ủ là 96 giờ là điều kiê ̣n tối ƣu cho viê ̣c lên men sinh PME ở cả môi trƣờng rắn (SSF) và cả môi trƣờng chìm (SmF).
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Thời gian địa điểm
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng - Trƣờng Đại học Cần Thơ .
Thời gian thực hiện: từ ngày 02/02/2009 đến ngày 05/05/2009.
3.1.2 Dụng cụ - hóa chất
3.1.2.1 Dụng cụ - thiết bị
Máy xay sinh tố
Máy đo độ ẩm nhanh AD 50 MX
Máy đo quang phổ Spectrophotometer (CECIL, UK)
Tủ cấy, tủ ủ Pipetman 1mL Thiết bị thanh trùng Máy khuấy từ Bếp gia nhiệt pH kế
Dụng cụ thủy tinh thông thƣờng
Một số dụng cụ khác 3.1.2.2 Hóa chất NaCl 0,25M Cồn 96° Bromocresol green Amonium sulfate (NH4)2SO4
Pectin táo, DE 70 ÷ 75% (Fluka).
3.1.3 Nguyên liệu táo
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu
Táo sau khi ép lấy nƣớc, phần bã còn lại đƣợc sấy khô một phần (10 ÷ 11% ẩm). Sau đó, bã đƣợc tách loại nƣớc ở nhiệt độ 60 1oC đến khi độ ẩm còn 4 1%, trong khoảng 3 ÷ 4 giờ. Bã táo khô đƣợc nghiền thành bột và đóng gói trong bao PE để sử dụng cho các thí nghiệm.
3.2.2 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng việc sử dụng phần mềm Statgraphic Plus 4.0. Sử dụng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai (ANOVA) để đƣa ra kết luận về sự sai biệt giữa các giá trị trung bình các nghiệm thức. Các số trung bình đƣợc so sánh bằng phƣơng pháp LSD.
3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc đến khả năng tổng hợp PME của A.niger
3.3.1.1 Mục đích
Xác định cơ chất thích hợp và tỷ lệ pha loãng sử dụng cho việc trích ly PME có hoạt tính cao nhất.
3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố A: tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc.
A1 = 1: 2 A2 = 1: 3 A3 = 1: 4 A4 = 1: 5 A5 = 1: 6 Số nghiệm thức: 5
Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 = 15 mẫu
3.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm
Cân 5 g bột táo cho vào bình nón 100 mL, thêm nƣớc với các tỉ lệ khác nhau (1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5 và 1: 6) sau đó thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Làm mát, cho 2 mL huyền phù bào tử với mật số cố định là 103
nhiệt độ phòng trong thời gian 96 giờ. Đo độ ẩm đạt đƣợc của mỗi bình để làm thông số theo dõi. Tỉ lệ bột táo và nƣớc cho enzyme PME có hoạt tính cao nhất sẽ đƣợc chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 9: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc
3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi
Độ ẩm môi trƣờng và hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiê ̣m thƣ́c thí nghiệm.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến khả năng tổng hợp PME
của nấm mốc Aspergillus niger
3.3.2.1 Mục đích
Xác định thời gian ủ thích hợp cho nấm mốc phát triển sinh tổng hợp PME đạt hiệu suất và hoạt tính cao nhất.
Môi trƣờng Pha loãng
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
Aspergillus niger
Ủ
Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase Thanh trùng
3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí có một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố B: Thời gian ủ ( giờ)
B1= 48 giờ B2= 72 giờ B3= 96 giờ B4=120 giờ B5= 144 giờ Số nghiệm thức: 5
Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 = 15 mẫu
3.3.2.3 Tiến hành thí nghiệm
Cân 5 g bột táo cho vào bình nón 100 mL, thêm nƣớc theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm trên. Sau đó tiến hành thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Làm mát các bình này sau khi thanh trùng, kế đến cho 2 mL huyền phù bào tử (103
cfu/mL) vào mỗi bình. Các bình cấy đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo hoạt tính ở các mức thời gian khảo sát. Chọn thời gian tối ƣu nhất sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Hình 10: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Môi trƣờng Pha loãng Làm nguội Thanh trùng Thu nhận enzyme
Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase
Aspergillus niger Nuôi cấy vi sinh vật
Ủ
3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dõi
Hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiê ̣m thƣ́c thí nghiê ̣m.
3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng tổng hợp
PME của nấm mốc
3.3.3.1 Mục đích
Xác định điều kiện môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp pectinmethylesterase là tốt nhất.
3.3.3.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố C: giá trị pH của môi trƣờng.
C1 = 3,5 C2 = 4,0 C3 = 4,5 C4 = 5,0
Số nghiệm thức: 4
Số mẫu thí nghiệm: 4 x 3 = 12 mẫu.
Hình 11: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của pH đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc
Môi trƣờng Pha loãng
Thu nhận enzyme
Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase
Aspergillus niger
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật Ủ
Thanh trùng Dung dịch đệm citrate
Chỉnh pH
3.3.3.3 Tiến hành thí nghiệm
Cân 5 g bột bã táo cho vào bình nón 100 mL, pha loãng với dung dịch đệm citrate theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm trên. Giá trị pH trung bình sau khi pha loãng đƣợc điều chỉnh về 3,5; 4,0; 4,5; 5. Đem thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi làm mát và cấy 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL), các bình đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng và thời gian tối thích ở thí nghiệm trên.
3.3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi
Hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiê ̣m thƣ́c thí nghiê ̣m.
Giá trị pH của dung dịch đệm cho hoạt tính PME cao nhất đƣợc chọn làm nhân tố cố định cho các thí nghiệm sau.
3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ amonium sulfate (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng sinh PME từ nấm mốc A.niger
3.3.4.1 Mục đích
Tìm ra tỉ lệ amonium sulfate bổ sung thích hợp nhất cho khả năng tổng hợp PME từ nấm mốc A.niger.
3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố D: Tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung (tính theo % nitơ)
D1 = 0,1% D2 = 0,2 % D3 = 0,3 %
Số nghiệm thức: 3
Số mẫu thí nghiệm: 3 x 3 = 9 mẫu.
3.3.4.3 Tiến hành thí nghiệm
Cho vào mỗi bình nón 5 g bột bã táo, pha loãng theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm 1 với dung dịch đệm citrate có pH tối thích ở thí nghiệm trên, và bổ sung amonium sulfate theo các tỉ lệ khảo sát, đem thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó làm mát và cấy 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL), đem ủ ở nhiệt độ phòng và thời gian tối thích nhất.
3.3.4.4 Chỉ tiêu theo dõi
Hình 12: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của amonium sulfate (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Môi trƣờng Pha loãng Dung dịch đệm Bổ sung (NH4)2SO4 Thanh trùng Làm nguội Cấy vi sinh vật Thu nhận enzyme Aspergillus niger Ủ
Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA TỈ LỆ PHA LOÃNG GIỮA CƠ CHẤT VÀ NƢỚC
Tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc chiếm vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp PME từ nấm mốc. Tỉ lệ pha loãng thích hợp sẽ tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tối ƣu để sinh PME. Do đó, thí nghiệm đƣợc tiến hành để khảo sát các tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất bã táo và nƣớc khác nhau (1: 2; 1: 3; 1: 4; 1: 5 và 1: 6) đến hiệu quả sinh PME từ A.niger. Ở thí nghiệm này, mật số nấm mốc đƣợc cố định là (103 cfu/mL), thời gian ủ 4 ngày ở nhiệt độ phòng.
Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc đến khả năng sinh PME của nấm mốc đƣợc thể hiện qua bảng số liệu 4 và hình 13.
Bảng 4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc đến khả năng sinh PME
Tỉ lệ pha loãng Độ ẩm Hoạt tính (U/mL)
1: 2 1: 3 1: 3 1: 4 1: 5 1: 6 51,61% 2,89 55,72% 2,50 63,45% 2,85 68,81% 2,61 74,16% 2,16 235,70c 3,55 325,94a 8,31 256,67b 5,67 228,87c 4,23 211,31d 4,84
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% . Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại.
Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại.
Từ kết quả của bảng 4 cho thấy, ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc có tác động lớn đến khả năng sinh PME của nấm mốc, thể hiện ở hoạt tính khác nhau.
Kết quả cho thấy hoạt tính của A. niger PME tăng từ tỉ lệ pha loãng 1: 2 lên đến giá trị 1: 3 và sau đó lại giảm dần khi mức độ pha loãng tăng đến tỉ lệ 1: 6. Trong đó, tỉ lệ pha loãng 1: 3 cho hoạt tính PME đạt cực đại (325,94 8,31 U/mL) và khác biệt có ý nghĩa khi so sánh với các mức độ cao hay thấp hơn.
Độ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Vì vậy, nếu độ ẩm môi trƣờng không thích hợp thì vi sinh vật sẽ khó tiếp nhận thức ăn, nên không phát triển đƣợc làm kìm hãm sự tổng hợp enzyme.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 Tỉ lệ pha loãng H oạt tí n h P M E ( U /mL)
Hình 13: Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa nƣớc và cơ chất đến hoạt tính PME
Theo Nguyễn Đức Lƣợng (2004) thì khi độ ẩm môi trƣờng cao (từ 60%) thì làm giảm mức độ thoáng khí và cũng tạo điều kiện cho một số vi khuẩn, nấm mốc khác phát triển. Ngƣợc lại, độ ẩm thấp (50%) làm môi trƣờng nuôi cấy khô, nấm mốc không có điều kiện thoáng khí để sinh bào tử, nên hoạt tính enzyme cũng thấp. Tƣơng ứng với tỉ lệ pha loãng của cơ chất bã táo: nƣớc là 1: 3, độ ẩm của môi