3.4.10.1 Phương pháp
Kiểm tra bacillus cereus theo iso 7932 - 1987
Cơng Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát
3.4.10.2 Phạm vi áp dụng
Phương pháp này áp dụng cho việc xác định số khuẩn lạc Bacillus Cereus trong thực phẩm cho người và động vật bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30°C.
3.4.10.3 Thiết bị và dụng cụ
- Tủ sấy điều chỉnh được ở 170 - 175°C trong thời gian khơng ít hơn 1h.
- Nồi hấp tiệt trùng ở 121 ± 1°C trong thời gian khơng ít hơn 20’
- Tủ ấm điều chỉnh được nhiệt độ 50 ± 1°C
- Tủ ấm điều chỉnh được nhiệt độ 30 ± 1°C
- Bếp cách thủy duy trì được ở nhiệt độ 45 ± 5°C và 50 ± 1°C
- Que cấy làm bằng platinum – iridium hoặc nickel-chromium, đường kính xấp xỉ 3mm và que cấy trịn cùng chất liệu.
- Máy đo pH: hiệu chuẩn được ở độ chính xác ± 0.1pH ở 25°C.
- Oáng nghiệm: 18 x 180mm
- Dĩa petri đường kính 90 -100mm; nếu cần cĩ thể 140mm
- Pipette chia độ: 10ml và 1ml, vạch chia tương ứng 0.5ml và 0.1ml với đầu pippet
đường kính 2 – 3mm
- Que trang thủy tinh hình tam giác đều cách 3cm, đầu que dài 20cm, cấu trúc dễ đốc tiệt trùng.
- Bĩp cao su
3.4.10.4 Mơi trường và thuốc thử
3.4.10.4.1 Lịng đỏ trứng(egg yolk emusion):
đã pha sẵn chuyên dùng, lưu giữ ở nhiệt độ 0-50C 3.4.10.4.2 Mơi trường thạch cơ bản
a) Mơi trường thạch pha sẵn dạng khan Bacillus Cereus selective agar (MYB agar).
Hịa tan 45g mơi trường khan trong 01 lít nước cất, lắc đều. Đun nhẹ, khuấy đều đến khi sơi và tan hồn tồn. Nếu cần, điều chỉnh về pH=7.2 rồi phân phối 90ml hoặc 180ml vào chai thủy tinh cĩ nắp, hấp tiệt trùng ở 120°C trong 15 phút. Trước khi sử dụng làm nguội đến 50°C, thêm 10ml egg yorlk
Cơng Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát
20% vào 90ml mơi trường. Lắc đều, rĩt mơi trường vào các dĩa petri đã khơ sạch, tiệt trùng; để đơng đặc rồi sấy đĩa trong tủ ấm ở 30°C ± 1°C trong 30’. b) Mơi trường thạch dùng để phân lập:
Chuẩn bị giống mơi trường MYB nhưng khơng thêm egg yorlk. Sau khi hấp tiệt trùng, làm nguội trong bếp cách thủy 45 ± 5°C, rĩt vào các dĩa petri và để đơng đặc. Ngay trước khi sử dụng, sấy khơ dĩa (lật úp ngược dĩa và sấy khơ) trong tủ ấm ở 50 ± 1°C trong 30’. Nếu chuẩn bị dĩa trước, các dĩa chưa qua sấy chỉ nên được giữ khơng quá 4h ở nhiệt độ phịng và khơng quá 1 ngày ở nhiệt độ 0 - 5°C.
3.4.10.4.3 Mơi trường glucose agar: Thành phần theo bảng sau:
Tryptone 10.0g Yeast extract 1.5g
Glucose (C6H12O6) 10.0g Sodium Chloride (NaCL) 5.0g
Bromocrerol purple (C12H15Br2NaO2S) 0.015g Agar 12-18g
Nước 1000ml
Hịa tan các thành phần vào nước bằng cách đun sơi. Điều chỉnh pH để sau khi hấppH = 7.0. Chuyển 15ml mơi trường vào ống nghiệm. Tiệt trùng 15 phút ở 121°C, 1atmNgay trước khi sử dụng làm chảy mơi trường trong bếp cách thủy hoặc vịi nước trong 10 phút rồi tiếp tục làm nguội nhanh đến khoảng 30°C.
3.4.10.4.4 Mơi trường Voges – Proskauer (VP): Thành phần theo bảng sau:
Peptone 7.0g
Glucose (C6H12O6) 5.0g
K2HPO4 (Dipotassium hydrogen orthophosphate) 5.0g
Sodium Chloride (NaCL) 5.0g
Cơng Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát
Hịa tan các thành phần hoặc mơi trường khan pha sẵn trong nước. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt trùng cĩ pH = 7.0. Rĩt 5ml mơi trường vào ống nghiệm (18 x 180mm), tiệt trùng 15 phút ở 121°C.
3.4.10.4.5 Thuốc thử Voges – Proskeuer (V.P):
- Dung dịch α - napthol (C10H8O) 5% trong cồn 96%. Giữ trong chai nâu cĩ nútchặt ở 0-5°C°
- Dung dịch Potassium hydroxide (KOH) 40% trong nước cất.
- Tinh thể creatine (C4H10N3O) 3.4.10.4.6 Nitrate medium:
Hịa tan 22g mơi trường khan trong 01 lít nước cất. Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt trùng cĩ pH = 7.0. Chuyển 5ml mơi trường vào ống nghiệm (18x180mm), tiệt trùng 15 phút ở 121°C.
3.4.10.4.7 Thuốc thử Nitrate:
- α - napthol (C4H10O): dung dịch 0.5% (W/V) trong acid acetic 5 mol/l. Hịa tan 0.5g α - napthol trong acid acetic và lọc qua giấy lọc vi sinh. Giữ trong chai nâu nút chặt (cĩ bĩp nhỏ giọt) ở 0 - 5°C.
- Sulfanilic acid, dung dịch 0.8% (W/V) trong acid acetic 5 mol/l: hịa tan acid sulfanilic trong acid acetic, lọc qua giấy lọc vi sinh.
- Thuốc thử hịan chỉnh: ngay trước khi sử dụng trộn đồng thể tích 2 dung dịch trên.
- Bột kẽm
3.4.10.5 Quy trình phân tích
3.4.10.5.1 Cân mẫu, pha lỗng nồng độ ban đầu
3.4.10.5.2 Cấy và ủ mẫu:
- Dùng pipet tiệt trùng hút 1ml dung dịch mẫu nguyên (dạng lỏng) hoặc pha lỗng (dạng khác) cho vào 3 đĩa thạch MYB (mỗi đĩa khoảng 0.3ml)
- Hoặc hút 0.1mL dung dịch mẫu nguyên (dạng lỏng) hoặc pha lỗng (dạng khác) trên bằng pipet tiệt trùng cho vào 1 đĩa thạch MYB (thực hiện 2 đĩa song song). Tùy theo nồng độ vi sinh vật cĩ trong mẫu mà thực hiện các nồng độ pha lỗng tiếp theo.
Cơng Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát
- Cẩn thận dùng que trang tiệt trùng trải đều mẫu lên bề mặt thạch khơng chạm que vào thành dĩa. Mỗi que trang dùng cho 1 dĩa. Để yên 15 phút ở nhiệt độ phịng.
- Ủ dĩa/ (úp ngược) trong tủ ấm 300C±10C trong 18 – 24h. Nếu khuẩn lạc chưa rõ ràng, ủ thêm 24h trước khi đếm.