Nguyên tử ở trạng thái hơi có khả năng hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định mà nó có thể phát ra trong quá trình phát xạ khi chiếu một chùm tia sáng có
Nuoc.com.vn Page 27 bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử đó. Khi đó ta thu được phổ hấp thụ của nguyên tố, quá trình này chỉ xảy ra đối với các vạch phổ nhậy, các vạch phổ đặc trưng và các vạch phổ cuối cùng của nguyên tố. Chùm tia chiếu vào đám hơi nguyên tử đó phải là chùm tia đơn sắc hay bức xạ cộng hưởng có bước sóng nhất định ứng với đúng tia phát xạ nhậy của nguyên tố cần nghiên cứu. Nguồn phát chùm tia đơn sắc có thể là đèn catot rỗng (HCL), các đèn phóng điện không điện cực (EDL) hay nguồn phát bức xạ liên tục đã được biến điệu. Trong phương pháp HTNT có hai kĩ thuật nguyên tử hoá mẫu đó là kĩ thuật nguyên tử hoá ngọn lửa và kĩ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa. Phương pháp HTNT cho độ nhạy và độ chọn lọc cao, đây là đặc tính rất ưu việt của phương pháp này, ngoài ra còn có một số điểm mạnh khác như: khả năng phân tích được gần 60 nguyên tố hoá học, ngoài các nguyên tố kim loại còn có thể phân tích được một số á kim (lưu huỳnh, clo…) và một số chất hữu cơ; Lượng mẫu tiêu tốn ít; Thời gian tiến hành phân tích nhanh, đơn giản… Ngày nay trong phân tích hiện đại, phương pháp HTNT được sử dụng rất có hiệu quả đối với nhiều lĩnh vực như y học, dược học, sinh học, phân tích môi trường, phân tích địa chất, … đặc biệt phân tích lượng vết các nguyên tố kim loại.
Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa (F-AAS)
Trong phương pháp HTNT ngọn lửa kĩ thuật nguyên tử hoá là ngọn lửa đèn khí. Nhiệt độ của ngọn lửa được điều chỉnh phụ hợp với từng nguyên tố và từng loại dung dịch mẫu. Khí được đốt để tạo ra ngọn lửa có thể là hỗn hợp C2H2 – KK hay hỗn hợp N2O - C2H2 hoặc H2 – C2H2. Dựa vào tính chất nguyên tử của từng nguyên tố mà chọn ngọn lửa cho nhiệt độ thích hợp.
Nuoc.com.vn Page 28 Phương pháp ngọn lửa cho kết quả đo có độ lặp lại tốt, tương đối dễ sử dụng nhưng tỉ lệ nguyên tử hoá mẫu chỉ khoảng 1/10, còn lại 9/10 bị đưa xuống ống dẫn do đó hiệu quả nguyên tử hoá thấp và độ nhạy không cao.
Phương pháp quang phổ hấp thụ không ngọn lửa (ETA-AAS)
Phương pháp HTNT không ngọn lửa ra đời sau phương pháp HTNT ngọn lửa, nó đã nâng cao được độ nhậy lên gấp hàng trăm, đến hàng nghìn lần so với phương pháp HTNT ngọn lửa. Tuy nhiên đối với phương pháp HTNT không ngọn lửa độ ổn định kém hơn và ảnh hưởng của phổ nền thường lớn. Nhưng với khoa học hiện đại các nhược điểm trên được khắc phục nhiều.
Quá trình nguyên tử hoá được thực hiện trong cuvet graphit hay thuyền tăng tan với thời gian ngắn (sự nguyên tử hoá tức khắc) nhờ năng lượng của dòng điện công suất lớn ở môi trường khí trơ. Nguồn năng lượng thường được dùng hiện nay là dòng điện có cường độ dòng rất cao (từ 50-600A) và hiệu điện thế thấp (nhỏ hơn 12V) hay năng lượng của dòng cao tần cảm ứng. Mẫu phân tích bằng phương pháp này có thể không cần làm giầu sơ bộ và lượng mẫu tiêu tốn ít.
Sự ra đời và phát triển kĩ thuật hidrua hoá [32]
Năm 1955 ông Walsh đã giới thiệu phương pháp HTNT, sau đó kĩ thuật phân tích này đã được sử dụng rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới. Tuy nhiên ban đầu việc xác định nguyên tử bằng HTNT còn gặp rất nhiều khó khăn trong việc mù hoá (sol khí hoá) dung dịch mẫu nhất là đối với các nguyên tố As, Se, Sb, Te… Mặt khác bước sóng hấp thụ của các nguyên tố này lại nằm xa vùng tử ngoại (nhỏ hơn 230nm), tại đó sự hấp thụ nền là lớn khi sử dụng ngọn lửa thông thường. Ví dụ: khi sử dụng ngọn lửa không khí – axetylen, As có bước sóng hấp thụ là 193,7 nm tại đó độ hấp thụ chỉ đạt 62%. Việc sử dụng ngọn lửa
Nuoc.com.vn Page 29 hydro – argon cho nhiệt độ thấp hơn giảm bớt được sự hấp thụ nền tới 15%, nhưng ngọn lửa này có đặc điểm hoá hơi mẫu kém, gây ra sai số do sự hấp thụ nền và sự hoà tan muối không hoàn toàn. Sự phát triển kĩ thuật nguyên tử hoá cho HTNT như nguyên tử hoá bằng lò graphit thì tránh được các khó khăn của HTNT bằng ngọn lửa. Tuy vậy việc sử dụng thiết bị này gặp một số vấn đề khác như: Tại bước sóng ngắn sự khuếch tán hạt (như hạt cacbon) gây ra sự nhiễu nền lớn, bên cạnh đó đối với nguyên tố dễ bay hơi như As, Se có thể bị mất trong quá trình nguyên tử hoá nên phép đo kém ổn định.
Năm 1969 Holak đã sử dụng kĩ thuật tạo hidrua kết hợp với HTNT. Ông dùng hỗn hợp kim loại và axit (kẽm và axit clohydric) để thực hiện phản ứng khử, kẽm và axit HCl được đựng trong một ống nghiệm có nitơ lỏng, trước tiên ống nghiệm được làm nóng lên rồi dẫn dung dịch có chứa As đi qua, khi As sinh ra được dẫn vào ngọn lửa không khí – axetylen trong môi trường nitơ. Bằng phương pháp này khắc phục được đáng kể nhược điểm của sự mù hoá, nâng cao được độ nhậy. Chất khử dùng cho phản ứng tạo hidrua là hidro mới sinh
2
2 2
2HCl ZnCl H EH H
Zn E m n
E là nguyên tố phân tích, m, n có thể giống hoặc khác nhau. Một số tác giả dùng nhôm hoặc magiê thay thế cho kẽm. Cũng có thể sử dụng clorua thiếc (II) hoặc KI làm chất khử và về sau người ta sử dụng natri tetrahydro borat (NaBH4) có nhiều thuận tiện hơn.
Khí hidrua được đẩy ra khỏi dung dịch chuyển đến buồng nguyên tử hoá nhờ dòng khí mang là khí trơ (Argon, Nitơ hoặc Heli). Có hai kĩ thuật tách hidrua chuyển vào buồng nguyên tử hoá là: Hệ gián đoạn và Hệ liên tục.
Nuoc.com.vn Page 30
Hệ gián đoạn: Hầu hết các kĩ thuật ban đầu dùng hỗn hợp kim loại và axit đều dùng kiểu gián đoạn. Trước khi được chuyển vào buồng nguyên tử hoá, toàn bộ khí hidrua sinh ra được giữ lại trong một bình cầu, Holak đã sử dụng hệ thống ngưng tụ hidrua trong ống hình chữ U đặt ở điều kiện nhiệt độ nitơ hoá lỏng, sau một phút chuyển nhiệt độ từ ống lạnh sang nóng khí hidrua sẽ bay hơi chuyển vào bộ phận nguyên tử hoá. Hệ thống gián đoạn có ưu điểm là làm tăng độ nhạy nhưng quá trình thực hiện phức tạp, sau mỗi lần thí nghiệm phải tháo rửa dụng cụ mới tiến hành thí nghiệm tiếp sau. Như vậy phép đo dễ bị ảnh hưởng bởi điều kiện làm việc.
Hệ liên tục: Sau khi natri tetrahidro borat được sử dụng làm chất khử, phản ứng xảy ra nhanh người ta đã sử dụng kiểu liên tục. NaBH4 được ổn định bằng việc kiềm hoá, dùng NaOH hoặc KOH nhưng nồng độ kiềm không được lớn, thông thường là 0,1 đến 2%. Khi đó mỗi phản ứng chỉ xảy ra trong 10 – 30 giây. Nói cách khác không cần thu tách khí hidrua mà khí AsH3 sinh ra được chuyển trực tiếp ngay vào bộ phận nguyên tử hoá. Hệ liên tục này rất thuận lợi với các hidrua không bền, quá trình đơn giản hơn hệ gián đoạn. Việc bơm mẫu và các thuốc thử có thể dùng bơm nhu động hay là hệ bơm nén.
Thiết bị HG – AAS có thể dùng bộ nguyên tử hoá lò graphit hoặc bộ nguyên tử hoá ngọn lửa. Hệ nguyên tử hoá bằng ngọn lửa, để nguyên tử hoá hợp chất hidrua khí được dẫn vào ống thạch anh hình chữ T. Ban đầu người ta dùng ngọn lửa Ar-H để đốt nóng ống thạch anh, Holak dùng ngọn lửa C2H2 – KK có nhiều ưu điểm hơn và được sử dụng nhiều hơn. Cũng có thể đốt nóng ống thạch anh bằng lò điện và sự phân huỷ AsH3 xảy ra trong môi trường khí trơ (Ar hoặc Ne, H2), Groulden và Brookband đã sử dụng loại thiết bị này. Ưu điểm của việc đốt
Nuoc.com.vn Page 31 nóng ống thạch anh bằng lò điện là có thể điều khiển để đạt được nhiệt độ tối ưu nhất, nhiệt độ phân bố cho ống thạch anh đều hơn, độ nhiễu nền thấp hơn.
Bằng kĩ thuật hidrua hoá độ nhậy của phương pháp tăng lên rất nhiều so với kĩ thuật mù hoá dung dịch thông thường.Dùng nguồn năng lượng là ngọn lửa và không khí thì độ nhạy phép xác định là 1g/ml theo vạch 196,1 nm, còn khi dùng ngọn lửa axetilen – không khí thì độ nhạy là 0,25 g/ml. Kĩ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa xác định Se trong máu và serum, giới hạn phát hiện là 0,8 g/ml, còn khi nối với cột Cellex làm giàu thì giới hạn phát hiện tương ứng là 2,1 và 2,4 ng/ml.
Kirkbring & Ranson, 1971 đã xác định As khi sử dụng kĩ thuật nguyên tử hoá ngọn lửa thông thường thì giới hạn phát hiện là 0,5-1 g/ml, còn khi sử dụng kĩ thuật không ngọn lửa, giới hạn phát hiện 0,1 mg/l.
Phương pháp hấp thụ nguyên tử sử dụng kĩ thuật hidrua hoá để phân tích As, Se đã tăng độ nhạy lên một cách vượt bậc cỡ vài g/l. Đây cũng chính phương pháp mà chúng tôi sử dụng nghiên cứu trong bản luận văn này.
Nuoc.com.vn Page 32
CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung
Như đã đề cập ở trên, điều kiện thí nghiệm với các thiết bị và đối tượng khác nhau là rất khác nhau, mẫu sinh học nói chung với máu và nước tiểu nói riêng là các đối tượng phân tích đòi hỏi độ chính xác cao, vì vậy vấn đề đầu tiên đặt ra là tối ưu hoá các điều kiện tiến hành thí nghiệm, khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu đến chất phân tích rồi mới phân tích thật, mẫu tiêu chuẩn để đánh giá kiểm tra phương pháp. Trên nguyên tắc thay đổi một yếu tố và cố định tất cả các yếu tố còn lại, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố một. Điều kiện phù hợp nhất vừa khảo sát và được chọn sẽ dùng cho thí nghiệm sau. Trên cơ sở đó chúng tôi xây dựng kế hoạch thực nghiệm để giải quyết các nhiệm vụ sau:
Nuoc.com.vn Page 33 Bước1: Chọn các thông số đo của máy đo phổ bao gồm:
Bước sóng hấp thụ của nguyên tố cần phân tích.
Khe sáng
Chiều cao Burner
Cường độ dòng đèn catot rỗng
Lưu lượng khí axetylen và khí đẩy (khí dẫn mẫu) Bước 2: Khảo sát các điều kiện tạo hợp chất hidrua
Tốc độ bơm nhu động
Tốc độ dẫn dung dịch NaBH4, HCl và khí Ar
Nồng độ NaBH4, HCl ảnh hưởng đến sự tạo asin, selenua
Nồng độ HCl, KI, thời gian khi tiến hành khử As (V) về As (III)
Nồng độ HCl, thời gian khi tiến hành khử Se (Vi) về Se (IV)
Thời gian bền của dung dịch sau khi khử.
Xây dựng đường chuẩn
Bước 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nguyên tố có mặt trong dung dịch mẫu. Bước 4: Lấy và bảo quản mẫu
Bước 5: Chọn phương pháp phân huỷ mẫu.
Bước 6: Đánh giá sai số và giới hạn của phương pháp
2.2. Giới thiệu chung về phương pháp hấp thụ nguyên tử kĩ thuật hidrua hoá hoá
Nuoc.com.vn Page 34 Dựa vào tính chất dễ tạo hợp chất hidrua cộng hóa trị của một số nguyên tố As, Sb, Se, Te, Bi,… các hidrua này đều dễ bay hơi, dễ bị phân huỷ người ta chế tạo bộ tạo khí hidrua kết hợp phương pháp HTNT, khí này được dẫn vào bộ phận nguyên tử hoá mẫu đo quang độ hấp thụ của chúng. As, Se tạo hợp chất hidrua công hoá trị có công thức AsH3, SeH2, trong hợp chất này As có số oxy hoá -3, Se có số oxy hoá -2. Trong các hợp chất As thường thể hiện số oxy hoá +3 và + 5 còn Se là +4 và +6, vì vậy người ta phải tiến hành phản ứng khử về As-3 và Se-
2
, với cả hai nguyên tố này chúng tôi đều dùng chất khử là NaBH4, trong môi trường axit NaBH4 có phản ứng:
NaBH4 + 3H2O + HCl H3BO3+ 8H+NaCl
H* là hidro mới sinh có tính khử mạnh nên khi có mặt các hợp chất của As, Se nó thực hiện ngay quá trình khử:
Mn+ + (m+n)H MHn+ mH+
Với As, hợp chất hydrua AsH3; với Se hợp chất selenua SeH2 được tạo thành nhờ NaBH4 trong môi trường axit. Hợp chất AsH3, SeH2 được mang vào buồng nguyên tử hoá bằng dòng khí trơ (Ar) liên tục.
Để chuyển hoá toàn bộ As thành AsH3, Se thành SeH2 thì trước hết phải oxi hoá As lên As5+, Se lên Se6+ sau đó khử về As3+ và Se4+ và cuối cùng chuyển hoá thành AsH3, SeH2 theo sơ đồ:
3 ) ( ) ( ) ,
(III V AsV As III AsH
As O K hidrohoa 2 ) ( ) ( ) , (IV VI SeVI Se IV SeH Se O K hidrohoa
Nuoc.com.vn Page 35 Dung năng lượng ngọn lửa C2H2-KK làm nguồn duy trì đám hơi nguyên tử As, Se, chiếu chùm tia đơn sắc từ đèn catot rỗng của As, Se vào đám hơi nguyên tử, khi đó As, Se sẽ hấp thụ những tia nhất định (As ở bước sóng 193,7 nm và Se ở bước sóng 196 nm là nhậy nhất). Sau đó nhờ bộ phận thu và phân ly phổ hấp thụ ta chọn và đo cường độ vạch phổ phân tích để phục vụ cho việc định lượng nó.
2.2.2. Phép định lượng của phương pháp
Sự phụ thuộc của cường độ vạch phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố vào nồng độ của nguyên tố đó trong dung dịch mẫu phân tích được nghiên cứu thấy rằng, trong một khoảng nồng độ C nhất định của nguyên tố trong mẫu phân tích cường độ vạch phổ hấp thụ và nồng độ N của nguyên tố đó trong đám hơi nguyên tử tuân theo định luật Lambe – Bia
A = K.N.L (1)
Trong đó:
A là cường độ hấp thụ của vạch phổ
K là hệ số thực nghiệm phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường hấp thụ, bề dày môi trường hấp thụ và hệ số hấp thụ nguyên tử của nguyên tố.
L là bề dày lớp hấp thụ (cm)
N là nồng độ nguyên tử của nguyên tố trong đám hơi nguyên tử.
Nếu gọi C là nồng độ của nguyên tố phân tích có trong mẫu đem đo phổ thì mối quan hệ giữa N và C được biểu diễn
Nuoc.com.vn Page 36 Trong đó b gọi là hằng số bản chất, nó phụ thuộc vào nồng độ C, tính chất hấp thụ phổ của từng nguyên tố và từng vạch phổ của nguyên tố đó. Như vậy ta có phương trình cơ sở của phép định lượng các nguyên tố theo độ hấp thụ của nó là:
A=a.Cb (3)
a=k.K gọi là hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào tất cả các điều kiện thực nghiệm để hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu.
Trong các phép đo ta thường tìm được một giá trị C=Co mà ứng với:
Mọi giá trị CxCo thì giá trị b=1, quan hệ giữa C và D là tuyến tính.
Với mọi giá trị Cx>Co thì 0<b<1, quan hệ giữa C và D là không tuyến tính. Phương trình (3) được gọi là phương trình cơ sở của phép đo định lượng các nguyên tố theo phổ hấp thụ nguyên tử. Đường biểu diễn phương trình này có 2 đoạn, một đoạn thẳng trong vùng CxCo và một đoạn cong Cx>Co.
D
Co
C
Nuoc.com.vn Page 37 Khi xác định hàm lượng các chất trong mẫu phân tích theo đồ thị chuẩn, chỉ nên dùng trong khoảng nồng độ tuyến tính (b=1)
2.3. Đánh giá các kết quả phân tích [10, 13, 39]
2.3.1. Giới hạn phát hiện (GHPH hay LOD) và giới hạn định lượng (GHĐL hay LOQ) hay LOQ)
Giới hạn phát hiện (GHPH) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra được một tín hiệu có thể phân biệt được một cách tin cậy với tín hiệu trắng (hay tín hiệu nền). Với ý nghĩa có thể phân biệt một cách tin cậy- đã có nhiều quan điểm