pH tối ƣu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6. Ở pH = 4, tốc độ tích luỹ sinh khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại. Mức độ hấp thụ chất dinh dƣỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hƣởng bởi pH nên chất lƣợng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trƣờng nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6.
2.7.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn
Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hoà oxy hoà tan. Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác động âm trên hoạt động sống của
tế bào nấm men. Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm men qua 2 giai đoạn: đầu tiên oxy đƣợc hoà tan vào môi trƣờng nuôi cấy sau đó nấm men mới hấp thụ oxy vào trong tế bào.
Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,764 m3) oxy để oxy hóa 1 kg đƣờng, nhƣng thực tế chỉ 1 phần nhỏ oxy bơm vào là đƣợc nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trƣờng (Lao Thị Nga, 1987).
Khi nuôi cấy nấm men ở qui mô công nghiệp, kích thƣớc của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hƣởng gián tiếp lên sự tăng trƣởng của nấm men.
2.8. Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn
Nấm men có rất nhiều chủng loại khác nhau, đa dạng trong chuyển hóa và tổng hợp các chất hữu cơ, phạm vi phân bố và điều kiện sống nhƣ nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, không khí… rộng nên dễ dàng chọn đƣợc các chủng có khả năng thích hợp với qui trình sản xuất và đáp ứng đƣợc yêu cầu đòi hỏi của thị trƣờng.
Có tốc độ phát triển nhanh, để tăng gấp đôi khối lƣợng cơ thể thì nấm men cần 1 – 2 giờ, vi khuẩn từ 20 – 60 phút, tảo từ 2 – 6 giờ, nấm sợi từ 4 – 12 giờ trong khi đó gà con cần 200 giờ, heo con cần 600 giờ, bê, nghé cần 1500 giờ (Nguyễn Lân Dũng, 1992).
Có khả năng phát triển trên nhiều nguồn dinh dƣỡng khác nhau cho phép ngƣời ta sử dụng các nguồn dinh dƣỡng sẵn có, rẻ tiền để sản xuất nhằm tăng sản lƣợng và giảm giá thành sản phẩm (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Không nhƣ nấm mốc, hầu hết nấm men không sinh độc tố trong môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng nhân tạo, trừ 1 số loài gây bệnh nhƣ Candida albican
(Nguyễn Văn Hƣng, 1990). Ngoài ra, khi lên men nấm men còn tạo mùi thơm đặc trƣng cho rƣợu, bia.
Nấm men cũng nhƣ vi sinh vật dễ gây đột biến bằng các tác nhân vật lý, hóa học, do đó có thể dùng kỹ thuật di truyền để biến đổi đặc điểm sinh học của nấm men theo hƣớng có lợi.
Giá trị dinh dƣỡng của nấm men rất lớn, đặc biệt là hàm lƣợng protein, acid amin và vitamin nhóm B trong nấm men rất cao, dễ tiêu hóa và hấp thụ
Với đặc điểm sinh lý của nấm men dễ dàng thiết lập dây chuyền công nghệ cao để khai thác các sản phẩm từ nấm men nhằm phục vụ nhu cầu thực tiễn.
Trong 24 giờ 1 con bò nặng 300 kg đƣợc chăm sóc tốt cũng chỉ tăng trung bình khoảng 1,1 – 1,2 kg, trong đó có khoảng 120 g protein. Nếu lấy 300 kg nấm men giống nuôi trong hệ thống lên men trong 24 giờ thì tạo 25.000 – 30.000 kg sinh khối, trong đó có khoảng 11.000 – 13.000 kg protein. Rõ ràng ta thấy sự tích luỹ protein ở nấm men cao hơn nhiều so với ở heo, bò, gà vài nghìn lần và tƣơng tự gấp vài trăm lần ở cây đậu, ngũ cốc (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970).
Trong nấm men có 1 số men tiêu hóa (amylase, protease…) và vitamin (đặc biệt là vitamin B) xúc tiến nhanh quá trình trao đổi chất, kích thích sự thèm ăn của gia súc. Nhờ đó, công tác chăn nuôi thu đƣợc lợi nhuận cao.
Tuy nhiên, sinh khối tế bào nấm men có nhƣợc điểm là mặc dù hàm lƣợng protein cao khoảng 55 – 60%, nhƣng đồng thời nó cũng chứa lƣợng acid nucleic quá cao (10%), điều này ảnh hƣởng tới sức khoẻ con ngƣời. Do đó, cần có các biện pháp làm giảm lƣợng acid nucleic này. Ngoài ra, màng tế bào nấm men khá vững chắc nên cần có biện pháp thích hợp để phá vỡ màng khi thu protein.
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970)
Bảng 2.2: Thành phần acid amin của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970)
Acid amin Tỷ lệ % Acid amin Tỷ lệ %
Cystin 0,54 Tryptophan 0,68 Histidin 1,19 Frolin 1,59 Phenylalanin 2,01 Glycin 2,10 Serin 2,20 Arginin 2,33 Threonin 2,50 Tyrosin 2,77 Lysin 3,11 Valin 3,30 Isoleucin 3,70 Leucin 3,80
Acid asparaginic 3,97 Alanin 5,78
Acid glutamic 6,74 Methionin 0,60
Thành phần Tỷ lệ %
Protid 44 – 45%
Glucid 25 – 35%
Lipid 1,5 – 5%
Các chất chiết xuất vô đạm
22 – 40%
Bảng 2.3: Thành phần khóang của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Thành phần Tỷ lệ % Thành phần Tỷ lệ % K2O 28 – 48 Fe2O3 0,1 – 7,3 Na2O 0,06 – 1,9 P2O5 41 – 59 CaO 1 – 5,5 SO3 0,4 – 6 MgO 4 – 8,1 SiO2 1,6
Bảng 2.4: Thành phần vitamin của nấm men (mg/kg)
Vitamin Hàm lƣợng (mg/kg)
Vitamin Hàm lƣợng (mg/kg) D2 (calciferol) 250 B6 (pyridoxyn) 60 B1 (thiamin) 40 B9 (acid folic) 4,2
B2 (riboflavin) 50 H (biotin) 2,0
B5 (nicotinic) 21 – 100
2.9. Những nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi 2.9.1. Ở nƣớc ngoài
Đã có nhiều công trình nghiên cứu trƣớc hết về bản chất sinh học, khả năng sinh hóa, phân loại của 1 số giống nấm men đƣợc sử dụng phổ biến trong sản xuất sinh khối tế bào nhƣ Saccharomyces, Torulopsis và Candida (Cainsnorth G et al, 1962, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Những nghiên cứu đầu tiên về sinh vật học trong bánh men rƣợu ở nƣớc ta đƣợc thực hiện vào cuối thế kỷ 19 bởi Calmette và học trò của ông vào 1948.
Các nhà khoa học trên thế giới đang hƣớng đến nghiên cứu chọn giống cho quá trình nâng cao công nghệ lên men truyền thống trên môi trƣờng xốp để làm giàu protein cho các sản phẩm giàu tinh bột nhƣ sắn và các phụ phẩm nông nghiệp nhƣ bã dừa, vỏ chuối, bã mía…(Schoch JJ, 1982, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Trƣớc đây, ngƣời ta đã sử dụng nấm sợi để lên men song do vấn đề sinh độc tố
mycotoxin làm các nhà chăn nuôi e ngại. Do đó, họ chú ý đến nấm men và 1 số vi khuẩn lên men truyền thống nhƣ vi khuẩn lactic (Rose A.H, 1981, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Chế phẩm ezyme vi sinh vật ngày nay đƣợc sản xuất ở qui mô công nghiệp. các chế phẩm này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi, trong chăn nuôi ezyme đƣợc dùng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp, làm tăng khả năng tiêu hóa cho gia súc.
Gần đây, hãng dƣợc Biocodex-Montronge (Pháp) cho ra sản phẩm men tiêu hóa có tên Bioflor 250 có chứa 250mg tế bào nấm men S. boulardii dùng để phòng trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa.
2.9.2. Ở trong nƣớc
Công tác nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ở nƣớc ta có thể nói đƣợc bắt đầu từ 1960 trở lại đây. Bao gồm các lĩnh vực sản xuất sinh khối tế bào, lên men thức ăn bột đƣờng và sản xuất chế phẩm sinh học.
Năm 1975, Trần Đức Trân và Nguyễn Công Xuân đã sử dụng sinh khối nấm men đƣợc sản xuất từ rỉ đƣờng của nhà máy đƣờng Vạn Điểm để chăn nuôi heo với tỷ lệ bổ sung 3 – 4% trong khẩu phần của heo 2 – 5 tháng tuổi đạt kết quả tốt (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Để tạo ra giống nấm men vừa có khả năng đƣờng hóa cao vừa có khả năng tạo sinh khối lớn, Viện Kỹ Thuật Sinh Học thuộc Trung Tâm Khoa Học và Công Nghệ Quốc Gia Việt Nam đã nghiên cứu cấy chuyển gen amylase đƣợc tách từ chủng Endomycopsis fibuligera và gây biến nạp cho Saccharomyces cerevisiae làm cho nó có 2 đặc tính đƣờng hóa cao và sinh tổng hợp protein cao dùng trong chế biến thức ăn (Trƣơng Nam Hải, 1994, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
Hiện nay, các nhà chăn nuôi khá quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm. Đặc trƣng của các chế phẩm sinh học này là sự kết hợp của nhiều chủng loại vi sinh vật có ích nhƣ
Bacillus. spp, Lactobacillus. spp, Saccharomyces. spp, các enzyme amylase, protease…
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian 3.1.1. Thời gian
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03 đến tháng 08 năm 2007.
3.1.2. Địa điểm
Phòng thực tập vi sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Mẫu khảo sát
Chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: tủ sấy, nồi hấp khử trùng autoclave, tủ lạnh, kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, máy li tâm, máy sục khí, micropipette…
Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa khuấy, bình tam giác, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, lame, lamelle, giấy đo pH…
3.2.3. Hóa chất
Hóa chất dùng trong phân lập và nuôi cấy nấm men nhƣ cồn 960, nƣớc cất, agar, KH2PO4, MgSO4, K2HPO4, (NH4)2PO4.
3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng khảo sát nuôi cấy là môi trƣờng cám gạo, môi trƣờng rỉ đƣờng mía, môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho.
Khảo sát sự phát triển của các chủng đƣợc phân lập từ 4 mẫu trên trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60
B.
Khảo sát sự phát triển của nấm men trong các loại môi trƣờng nuôi cấy khác nhau.
Khảo sát thời gian thu nhận sinh khối nấm men trong các loại môi trƣờng trên. Khảo sát sự phối hợp nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía.
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phân lập nấm men 3.4.1. Phân lập nấm men
3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì
Pha mẫu với 1 ít nƣớc muối sinh lý 90/00 rồi đem cấy ria trên mặt thạch Sabouraud.
Để ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 – 48 giờ.
Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, đƣờng kính khoảng 2 – 3 mm, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái.
3.4.1.2. Mẫu đu đủ và nho
Chọn những chỗ bị dập, hơi có mùi rƣợu rồi cấy ria trên mặt thạch Sabourand.
Để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ.
Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái.
Sau khi xác định đƣợc đó là chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces thì đem cấy chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng Sabouraud để tăng sinh.
3.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B
3.4.2.1. Mục đích
Từ các chủng của 4 nguồn mẫu trên, chọn chủng có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Thông số cố định
Môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng mật rỉ đƣờng mía 60B. Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 100ml.
Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Thời gian nuôi cấy: 36 giờ.
Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí.
3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi
Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu.
3.4.2.4. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí 1 yếu tố, lặp lại 2 lần với 4 nghiệm thức.
Mẫu phẩm Chế
Men
bánh mì Đu đủ Nho Lần 1
3.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces
Từ kết quả thí nghiệm 1, chúng tôi chọn 2 chủng có khả năng sinh trƣởng tốt nhất làm đối tƣợng nghiên cứu cho thí nghiệm 2.
3.4.3.1. Mục đích
Tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch thích hợp cho số lƣợng tế bào nấm men lớn nhất.
3.4.3.2. Thông số cố định
Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 300ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Số lƣợng mẫu ban đầu.
Có sục khí.
3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi
Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu, đơn vị tính tb/ml.
Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud, đơn vị tính là cfu/g.
Phƣơng pháp đếm tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chỉ cho biết tổng số tế bào trong dịch nuôi cấy (bao gồm cả số tế bào sống và tế bào chết). Với mục đích nuôi cấy nấm men dùng làm chế phẩm sinh học nên yêu cầu số lƣợng tế bào sống trong chế phẩm phải cao. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa cho phép xác định số lƣợng tế bào nấm men sống trong chế phẩm, từ đó ta có thể đánh giá các yếu tố ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm.
3.4.3.4. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch, lặp lại 3 lần.
Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy có 2 mức độ:
T1:200 ml môi trƣờng rỉ đƣờng 60B + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. T2: 200 ml môi trƣờng cám gạo + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. Yếu tố thời gian thu hoạch có 3 mức độ: 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ.
3.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm
Sau khi tiến hành xong thí nghiệm 2,chúng tôi thu hoạch sinh khối tế bào nấm men và sản xuất thành chế phẩm. Thử nghiệm trộn sinh khối nấm men với chất nền là cám gạo và bột mì, trong đó chia thành 3 phần:
Phần 1: không bổ sung vitamin C. Phần 2: bổ sung 50/000 vitamin C. Phần 3: bổ sung 10
/00 vitamin C.
Sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng, tiến hành đếm số lƣợng tế bào nấm men còn sống trong chế phẩm bằng phƣơng pháp khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud.
3.4.4.1. Mục đích
Xác định đƣợc thời gian thu hoạch và điều kiện bảo quản thích hợp để nấm men có khả năng sống lâu nhất trong chế phẩm.
3.4.4.2. Thông số cố định
Thời gian bảo quản: 22 ngày. Nhiệt độ bảo quản: nhiệt độ phòng.
3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi
Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1 g chế phẩm bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa, đơn vị tính là cfu/g.
3.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm
Các mẫu lấy từ thí nghiệm 3 và chỉ tiêu theo dõi cũng là số lƣợng tế bào sống trong 1 g chế phẩm (đơn vị tính là cfu/g), nhƣng lúc này không xét đến ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C).
3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung
S. cerevisiae từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng Sabouraud lỏng trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, B. subtilis từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth) trong 24 giờ ở 370C rồi cấy vào các bình nuôi cấy theo tỷ lệ sau:
Bình 1: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0B). Bình 2: 1 ml dịch S. cerevisiae + 1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+1B). Bình 3: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,1B). Bình 4: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,01 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,01B).
3.4.6.1. Mục đích
Tìm hiểu ảnh hƣởng của B. subtilis lên sự phát triển của S. cerevisiae.
3.4.6.2. Thông số cố định
Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 200 ml.